王愛紅，龐秋霞，陳美霓，米志寬，符兆英*，楊文杰，向云濤

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，延安716000;2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院;*通訊作者，E-mail:fu_zhaoying@163.com)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居首位［1，2］，從天然資源如植物或中藥中尋找提取毒副作用小的治療肺癌的藥物，有著特別重要的意義［3－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳漿大戟提取物具有誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用，并對(duì)其作用機(jī)制做了初步研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人肺癌細(xì)胞A549由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室保存。噻唑藍(lán)(MTT)、碘化丙錠(PI)、二甲亞砜(DMSO)(sigma－Aldrich公司，美國(guó));RPMI 1640培養(yǎng)基(invitrogen公司，美國(guó))，四季青新生小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco BRL公司，美國(guó))，Trizol(invitrogen 公司，美國(guó))，JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，加拿大);Bcl-2、Bax、β-actin 引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，熒光倒置顯微鏡及CCD采用Nikon顯微鏡，流式細(xì)胞儀 FACS Calibur(Becton Dickinson公司，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司，美國(guó))，酶標(biāo)儀采用美國(guó)Bio－Rad 680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)加入10%小牛血清，100 U/ml青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素。放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 乳漿大戟提取物制備 乳漿大戟地上全草陰干，用植物搗碎機(jī)粉碎，加適量純水制成混懸液，粗濾紙過濾收集濾液，低溫風(fēng)干稱重，加純水配制成100 g/L，0.22μm濾器過濾保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT法檢測(cè)乳漿大戟提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以5×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔200μl。次日細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，添加乳漿大戟提取物，其終濃度為0，0.2，0.4，0.8 g/L，每個(gè)濃度設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng) 24，48，72 h 加入 MTT 20 μl/孔(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150μl/孔，充分混勻，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)其吸光度(A)值，計(jì)算平均A值和抑制率(IR)。試驗(yàn)重復(fù)三次。IR=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4 Hoechst33528和PI染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。次日細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，添加乳漿大戟提取物，其終濃度為0，0.2，0.4，0.8 g/L，培養(yǎng) 48，72 h 后棄去培養(yǎng)基，2 ml PBS洗二次，加入50 g/L的PI染料，避光染色30 min，Hoechst33528染色按照說明書進(jìn)行，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)改變。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)樣品準(zhǔn)備:①細(xì)胞處理方法同1.2.3，培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞(1－5)×106個(gè)，500－1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。②3 ml PBS洗一次。③離心去除PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1 h。④離心棄去固定液，3 ml PBS重懸5 min。⑤400目的篩網(wǎng)過濾1次，500－1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。⑥用1 ml PI染液，4℃避光30 min。⑦流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 細(xì)胞處理同1.2.3，培養(yǎng)48 h后吸棄全部培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞一次，加1 ml培養(yǎng)液和1 ml JC染色工作液，充分混勻，在培養(yǎng)箱37℃孵育20 min;37℃孵育結(jié)束后，吸棄含染色液的培養(yǎng)液，用JC染色緩沖液洗滌2次;加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

本實(shí)驗(yàn)采用JC-1熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。正常的細(xì)胞膜電位較高，鏡下觀察為紅色;當(dāng)出現(xiàn)凋亡時(shí)，膜電位下降，鏡下觀察為綠色。

1.2.7 RT-PCR 將 A549細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，接種濃度為 3×105/ml，細(xì)胞處理方法同1.2.3。按Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，DEPC水溶解，取少量樣品進(jìn)行紫外分光光度計(jì)定量和瓊脂糖凝膠電泳分析，－80℃保存。取1μg總RNA在20μl體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系包括總 RNA 1μg、引物 oligo(dT)181μl、5×Reaction buffer 4 μl、RNase inhibition 1 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、Reverse Transcriptase1 μl、加水至20 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件42 ℃1 h，70 ℃5 min，取2 μl cDNA產(chǎn)物在25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR儀中擴(kuò)增，β－actin作為內(nèi)對(duì)照，引物序列、大小及退火溫度見表1。PCR反應(yīng)體系包括cDNA產(chǎn)物2μl、上游引物和下游引物各加1 μl、2×PCR mix 12.5 μl、水8.5 μl，混勻離心，放進(jìn)梯度PCR儀，按以下條件擴(kuò)增，94℃預(yù)熱3 min，94 ℃ 3 s，59.1 ℃(bax)、64.2 ℃(bcl－2)、61.8 ℃(β－actin)3 s、72 ℃1 min，共 30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，并用Gene凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相及半定量分析。

表1 被檢測(cè)基因所使用的引物序列Table 1 Sequence of primers of target genes

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，用不同濃度乳漿大戟提取物處理細(xì)胞，細(xì)胞增殖被抑制，各時(shí)點(diǎn)各劑量組與對(duì)照組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最大抑制率達(dá)46.3%(見表2)。

表2 MTT法測(cè)乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n=18，±s)Table 2 Inhibition effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of A549 cell by MTT assay(n=18，±s)

表2 MTT法測(cè)乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n=18，±s)Table 2 Inhibition effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of A549 cell by MTT assay(n=18，±s)

與對(duì)照組(0 g/L)相比，*P＜0.05;與0.2 g/L 組相比，△P＜0.05

0.4 g/L 0.342±0.055* 13.8±8.3△ 0.352±0.042* 41.9±2.6△ 0.523±0.038* 45.2±1.6△0.8 g/L 0.318±0.033* 19.2±3.9△ 0.326±0.046* 46.3±3.2△ 0.542±0.022* 43.1±2.8△

2.2 乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞飽滿呈梭形，胞質(zhì)豐富，大小均一，單層貼壁生長(zhǎng)，處理組的細(xì)胞減少，細(xì)胞間隙增大，貼壁狀態(tài)差，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜皺縮，折光性小，細(xì)胞脫落明顯(見圖1)。

圖1 乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h的細(xì)胞形態(tài)變化 (×100)Figure 1 Morphology of A549 cells after treated with 0.8 g/L extracts of Euphorbia esula for 48 h (×100)

圖2 乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h的細(xì)胞核染色質(zhì)形態(tài)變化 (×100)Figure 2 Effects of on morphology of cell nuclear of A549 cells after treated with different concentrations of extracts of Euphorbia esula for 48 h (×100)

圖3 乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h的線粒體膜電位變化 (JC－1染色，×200)Figure 3 Changes of mitochondrial membrane potential of A549 cells after treated with extracts of Euphorbia esula for 48 h(JC－1 staining，×200)

Hoechst33528和PI染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈完整橢圓形，細(xì)胞數(shù)目多，幾乎無凋亡細(xì)胞;與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞核皺縮變形，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞體積變小、變圓，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，呈致密強(qiáng)熒光(圖2，見第548頁)。

2.3 乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，不同濃度的乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡率增大，各個(gè)處理組的細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組細(xì)胞相比有差異(P＜0.05，見表3)。

表3 乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h的凋亡率(n=3，±s)Table 3 Effect of extracts of Euphorbia esula on apoptosis of A549 at 48 h by flow cytometry (n=3，±s)

表3 乳漿大戟提取物作用A549細(xì)胞48 h的凋亡率(n=3，±s)Table 3 Effect of extracts of Euphorbia esula on apoptosis of A549 at 48 h by flow cytometry (n=3，±s)

與對(duì)照組(0 g/L)相比，*P＜0.05

0.4 g/L 組 21.42±1.01*0.8 g/L 組 46.57±1.76*

2.4 乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

熒光顯微鏡下觀察可見對(duì)照組細(xì)胞呈紅色，表明線粒體膜電位正常，而處理組細(xì)胞多數(shù)呈綠色，表明線粒體膜電位下降，細(xì)胞凋亡，說明線粒體途徑參與乳漿大戟提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖3，見第548頁)。

2.5 bax和 bcl－2的 mRNA 表達(dá)

RT－PCR結(jié)果顯示，乳漿大戟提取物處理A549細(xì)胞，bax的 mRNA表達(dá)的逐漸增加，bcl－2的mRNA表達(dá)逐漸減弱(圖4A)。以內(nèi)參照β－actin校正，以校正值為基因的表達(dá)豐度，bcl－2和bax的mRNA表達(dá)呈劑量－反應(yīng)關(guān)系(圖4B)。

圖4 乳漿大戟提取物對(duì)A549細(xì)胞的bax、bcl－2 mRNA表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of extracts of Euphorbia esula on mRNA expression of bax and bcl－2 in A549 cells by RT-PCR

3 討論

我國(guó)的中草藥資源豐富，而且中草藥具有有效成分多、結(jié)構(gòu)多樣、抗癌譜廣、副作用小、開發(fā)成本低等特點(diǎn)，日益受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的關(guān)注［7－9］。進(jìn)入新世紀(jì)以來，在回歸大自然的觀念和醫(yī)療模式轉(zhuǎn)換的影響下，對(duì)天然藥物的探索與研究更加受到青睞，從天然產(chǎn)物中尋找保健預(yù)防和治療疾病的有效成分已經(jīng)成了國(guó)際上的大潮流。有不少學(xué)者認(rèn)為，天然藥物今后將會(huì)逐漸成為醫(yī)藥市場(chǎng)的主流［10－12］。

乳漿大戟(Euphorbia esula L.)是一種并不多見的植物，根據(jù)中國(guó)植物志［13］，乳漿大戟又稱貓眼草(中國(guó)高等植物圖鑒)，乳漿草(北京植物志)，華北大戟(秦嶺植物志)，新疆大戟(中國(guó)沙漠植物志)，太魯閣大戟(臺(tái)灣植物志)，岷縣大戟(云南植物研究)，寬葉乳漿大戟(東北草本植物志)，東北大戟，松葉乳汁大戟等。乳漿大戟為多年生草本，是國(guó)產(chǎn)大戟屬植物中分布最廣、變異幅度最大的種之一，分布于全國(guó)大部分地區(qū)，除海南、貴州、云南和西藏外。乳漿大戟全草入藥，具拔毒止癢之效。

我們采集乳漿大戟的地上全草，提取水溶性組分，經(jīng)除菌過濾后，用人肺癌細(xì)胞A549作抑制細(xì)胞增殖和活力的MTT實(shí)驗(yàn)、PI和Hoechst33528染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、JC－1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位改變、并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，乳漿大戟提取物能抑制A549細(xì)胞的增殖，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)，最大抑制率為46.3%;顯微鏡下觀察，乳漿大戟提取物處理后的A549細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征;JC－1染色顯示細(xì)胞線粒體膜電位下降，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示乳漿大戟提取物可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，凋亡率可達(dá)48.4%。

我們進(jìn)一步做了乳漿大戟提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的初步研究，RT－PCR結(jié)果顯示，人肺癌A549細(xì)胞中bax表達(dá)上調(diào)、bcl－2表達(dá)下調(diào)，bax和bcl－2是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，參與線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)。有研究表明，線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一［14］。線粒體膜電位下降與線粒體膜通透性(MPT)改變有關(guān)，MPT允許水和溶質(zhì)進(jìn)入基質(zhì)，引起線粒體的膨脹，內(nèi)膜的膨脹導(dǎo)致外膜的破裂，從而使Cyt C、smac/Diabod、AIF等與細(xì)胞凋亡有關(guān)的重要因子釋放到胞質(zhì)中［l5］，使細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)破壞、功能紊亂，發(fā)生凋亡。bcl－2能穩(wěn)定細(xì)胞及線粒體膜，阻止細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)而抑制細(xì)胞凋亡，bax以二聚體或多聚體形式結(jié)合到線粒體膜上，改變膜的通透性，引起細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。綜上所述，乳漿大戟提取物可能是通過線粒體途徑，上調(diào)bax的表達(dá)、下調(diào)bcl－2表達(dá)從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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