關(guān) 波，秦 明，張明鑫，劉震雄，張 超，王景杰

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710038;*通訊作者，E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

功能性消化不良、腹脹、便秘等胃腸動力障礙性疾病屬于臨床常見病多發(fā)病，它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來中醫(yī)藥治療胃腸動力障礙性疾病日益受到關(guān)注，由于其作用機(jī)制不清，進(jìn)而導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用方面的限制。張仲景的大承氣湯是一個經(jīng)典的“通便瀉熱”組方，“通便瀉熱”也是該方最為重要的立意，大承氣湯其主證可歸納為“痞、滿、燥、實(shí)”，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的促胃腸動力為異曲同工，然而大承氣湯促胃腸動力作用機(jī)制不清，進(jìn)而限制了中藥在臨床上的應(yīng)用。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)原位于呼吸中樞和心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中具有慢波起搏性質(zhì)的胃腸動力起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)上的超極化激活性環(huán)核苷酸門控性陽離子非選擇性通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation nonselective channel，HCN)在胃腸道上具有廣泛的分布，且前期我們證明其可能為胃腸道動力起搏的重要離子通道［1－5］。那么大承氣湯促胃腸動力作用是否也與HCN1存在明顯關(guān)系，目前未見明確報道。

1 材料和方法

1.1 大承氣湯組方

按照大黃12 g，厚樸15 g，枳實(shí)12 g，芒硝9 g組方進(jìn)行藥物煎制。煎制好的藥物裝瓶冷藏備用。

1.2 動物分組及給藥

取成年雄性SD大鼠40只，用隨機(jī)表法將其隨機(jī)分成兩個組分別做胃腸電檢測和免疫熒光檢測。各實(shí)驗隨機(jī)分為4個組(n=5):正常組，生理鹽水組(灌胃給予等體積生理鹽水)，大承氣湯組，ZD7288(HCN1的特異性阻斷劑)+大承氣湯組。阻斷劑組在麻醉大鼠前2 h，經(jīng)大鼠尾靜脈給予HCN1的特異性阻斷劑ZD7288(0.5 mmol/L)干預(yù);由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，體重(250±20)g(動物合格證號:SCXK(軍)2002—005)。將大鼠置于安靜、溫暖(20℃)、避光環(huán)境中飼養(yǎng)。灌胃給予藥物量為前期預(yù)實(shí)驗胃動力變化最大組劑量(1 ml/kg，每毫升大承氣湯折合生藥57 g)。

1.3 主要實(shí)驗儀器、抗體及試劑

超低溫冰箱(－80℃)(美國NUAIR公司);振蕩切片機(jī)(日本DOSAKA公司);Confocal激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司);兔抗C－KIT多克隆抗體1∶1 000稀釋液、鼠抗HCN1單克隆抗體1∶500稀釋液、1∶500 羊抗兔FITCC－KIT、1∶500 驢抗兔IgG(均購自美國SIGMA公司);1∶500驢抗鼠Texas red HCN1(MOLECULAR PROBES公司);1∶2 000鼠抗C－kit抗體(CHEMICOM公司)和1∶2 000兔抗HCN1抗體(CHEMICOM公司)等。

1.4 實(shí)驗標(biāo)本的處理、檢測

1.4.1 取材和固定 將10只SD大鼠在40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉下，開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以100 ml生理鹽水沖洗血液，隨后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PB，pH 7.4)先快后慢灌流固定2 h。取胃的底、體交界1/3處、空腸置于300 g/L蔗糖中(4℃)直至組織沉底，恒冷箱切片機(jī)切制連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01 mol/L PBS中存放。

1.4.2 免疫熒光化學(xué)標(biāo)記 切片在0.1 mol/L PBS中漂洗后，放入含0.3%Triton X－100的0.1 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色:①分別入兔抗C－KIT多克隆抗體稀釋液(1∶1 000)、鼠抗 HCN1 單克隆抗體稀釋液(1∶500，美國Sigma公司)，孵育24 h(室溫);②加入結(jié)合了熒光素的二抗:羊抗兔FITC(1∶500)C－KIT;驢抗鼠Texas red(1∶500)HCN1，避光孵育 2 h(室溫)。0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片后，將實(shí)驗組和對照組的切片各取10張，在Confocal激光共聚焦顯微鏡下觀察采圖。Cajal間質(zhì)細(xì)胞呈網(wǎng)格樣，染色呈黃褐色熒光，HCN1染色呈橘紅色熒光。

1.4.3 胃電及空腸MMC檢測 胃電活動統(tǒng)一參數(shù)設(shè)定為“生物電，25 mV，直流，30 Hz”，將所記錄的胃電生理圖頻率和波幅進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;空腸MMC統(tǒng)一參數(shù)設(shè)定為“頻率100 Hz，時間常數(shù)為0.01 s，高頻濾波1 kHz，對所記錄的周期，活動期/周期(%)和每分鐘快波數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 大承氣湯對胃腸動力的促進(jìn)作用及ZD7288對其作用的影響

實(shí)驗結(jié)果顯示，大承氣湯對大鼠胃電及小腸MMC有顯著影響，大承氣湯灌胃組與正常組，生理鹽水組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)給予HCN1受體阻斷劑ZD7288，大承氣湯的促胃腸動力作用即胃電以及小腸的MMC呈現(xiàn)顯著降低狀態(tài)，ZD7288+大承氣湯組與正常組，生理鹽水組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，且與大承氣湯灌胃組相比差異更為顯著(P＜0.01，見表1、2)。

表1 大承氣湯對大鼠胃電活動影響(n=5，±s)Table 1 Effect of Dachengqi decoction on gastric electrical activity(n=5，±s)

表1 大承氣湯對大鼠胃電活動影響(n=5，±s)Table 1 Effect of Dachengqi decoction on gastric electrical activity(n=5，±s)

與正常組和生理鹽水組比較，*P＜0.05;與大承氣湯組比較，#P＜0.01

大承氣湯組 5.90±0.5 1.06±0.10*ZD7288+大承湯組 2.42±0.39*# 0.41±0.03*#

表2 大承氣湯對大鼠小腸MMC的影響(n=5，±s)Table 2 Effect of Dachengqi decoction on MMC in rats(n=5，±s)

表2 大承氣湯對大鼠小腸MMC的影響(n=5，±s)Table 2 Effect of Dachengqi decoction on MMC in rats(n=5，±s)

與給藥前比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;給藥后與大承氣湯組比較，#P＜0.05

給藥后 10.32±5.01* 41.35±4.56* 188.49±15.26*ZD7288+大承氣湯組 給藥前 16.89±3.17 30.18±4.19 117.22±14.28給藥后 37.65±4.89＊＊# 13.51±4.55＊＊# 77.45±10.52＊＊#

2.2 大承氣湯對HCN1的表達(dá)及ZD7288對其作用的影響

實(shí)驗結(jié)果顯示，大承氣湯對大鼠胃及小腸黏膜中的HCN1的表達(dá)具有顯著激活作用(圖1，2，見第546頁)，大承氣湯組熒光光度值與正常組和生理鹽水組的熒光光度值相比存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，見圖3，4);當(dāng)給予HCN1受體阻斷劑ZD7288，大承氣湯對HCN1的激活作用呈現(xiàn)顯著降低狀態(tài)，ZD7288+大承氣湯組與正常組和生理鹽水組的熒光光度值存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，ZD7288+大承氣湯組熒光光度值與大承氣湯灌胃組熒光光度值相比差異更為顯著(P＜0.01，見圖3，4)。

圖1 大承氣湯對胃黏膜中HCN1的激活作用Figure 1 Promotive effect of Dchenqi decoction on HCN1 in gastric mucosa of rats

圖2 大承氣湯對小腸黏膜中HCN1的激活作用Figure 2 Promotive effect of Dchenqi decoction on HCN1 expression in intestinal mucosa of rats

圖3 大承氣湯對胃黏膜中HCN1激活作用的熒光光度值比較Figure 3 Effect of Dchenqi decoction on fluorescence value of HCN1 in gastric mucosa of rats

圖4 大承氣湯對小腸黏膜中HCN1激活作用的熒光光度值比較Figure 4 Effect of Dchenqi decoction on fluorescence value of HCN1 in intestinal mucosa of rats

3 討論

大承氣湯是我國傳統(tǒng)中醫(yī)常用的藥物，是通里攻下法的代表方劑，出自《傷寒論》，主治以痞、滿、燥、實(shí)為主癥的陽明腑實(shí)證，中醫(yī)認(rèn)為其病理機(jī)制系由寒邪實(shí)證，其系由寒邪傳陽明之腑，入里化熱，與腸中燥屎相結(jié)，阻塞腸道，腑氣不通所致［6］。大承氣湯由大黃、芒硝、厚樸、枳實(shí)組成。方中以大黃、芒硝瀉下通便，蕩滌腸胃邪熱積滯，以治燥實(shí)，輔以厚樸、枳實(shí)行氣散結(jié)，導(dǎo)滯消痞，以治痞滿［6］。四藥相和，瀉下行氣并重，共奏峻下熱結(jié)之功?，F(xiàn)代臨床將其用于急性腸梗阻、急性胰腺炎、急性膽囊炎等急腹癥的治療，通里攻下是其關(guān)鍵。大量的臨床觀察及臨床試驗表明大承氣湯對正常及不同病理狀態(tài)下的胃腸運(yùn)動均有明顯促進(jìn)作用［7－9］。本研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯對胃電活動有非常明顯的影響，它可以顯著增強(qiáng)胃電活動的幅度與頻率，并且在我們前期預(yù)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)其存在劑量依賴性而且其促動力作用在這些方面與嗎丁啉相當(dāng)，從而增強(qiáng)胃的蠕動。提示大承氣湯能增強(qiáng)胃的排空能力。通過我們觀察大鼠小腸的MMC的變化情況我們發(fā)現(xiàn)，大承氣湯明顯改善了大鼠小腸的MMC，進(jìn)一步提示了大承氣湯的促胃腸動力作用。

另外，本研究采用了阻斷技術(shù)后觀察到，當(dāng)給予胃腸動力起搏細(xì)胞ICC上離子通道HCN1的特異性阻斷劑ZD7288后再給予大承氣湯，實(shí)驗大鼠的胃電活動及小腸的 MMC均產(chǎn)生顯著的降低，提示HCN1是大承氣湯的作用靶點(diǎn)，這為進(jìn)一步探討大承氣湯的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

［1］Midrio P，Vannucchi MG，Pieri L，etal.Delayed development of interstitial cells of Cajal in the ileum of a human case of gastroschisis［J］.JCell Mol Med，2008，12(2):1582－1590.

［2］Harzheim D，Pfeiffer KH，F(xiàn)abritz L，etal.Cardiac pacemaker function of HCN4 channels in mice is confined to embryonic development and requires cyclic AMP［J］.EMBO J，2008，27(4):692－703.

［3］楊琦，黃裕新，王偉，等.白蘿卜提取物對胃電起搏區(qū)縫隙連接的影響［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18(5):444－446.

［4］Li D，Song LS.Deciphering the pecking order of HCN4 expression in the developing heart:lessons from chicken［J］.Heart Rhythm，2011，8(8):1264－1265.

［5］徐純，張超，秦明，等.HCN1在胃腸道的分布及特點(diǎn)［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，43(8):564－566.

［6］任鴻義，任鵬，吳迪.淺析《傷寒論》大承氣湯的證治［J］.光明中醫(yī)，2013，28(4):654－655.

［7］許繼德，樊雪萍，孫黎明，等.大承氣湯對內(nèi)毒素血癥小鼠胃腸運(yùn)動的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13(24):3249－3250.

［8］李穎，田如玉，馬仲麗，等.大承氣湯對胃腸激素的分泌及其促胃腸運(yùn)動關(guān)系的研究［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，23(5):19－20.

［9］張啟，榮袁杰，李莉.大承氣湯與小承氣湯對兔胃底條平滑肌運(yùn)動的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1672－1673.