崔麗霞，郭 鋒，李新毅

(1長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長(zhǎng)治 046000;2呂梁市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者，E-mail:xinyili2003@aliyun.com)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原因未名的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床特征為隱襲起病、持續(xù)進(jìn)行性智能衰退而無(wú)緩解。研究表明Aβ在腦內(nèi)的異常沉積是AD發(fā)病較為初始的因素。載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)在AD發(fā)生發(fā)展中所起的作用越來(lái)越受到關(guān)注。其結(jié)構(gòu)基因存在多態(tài)性，基因型ε4是AD的高危因素和易患因素，ε4對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)apoE4和Aβ的結(jié)合可能促進(jìn)了AD的發(fā)生［1］。AD患者重要的組織形態(tài)學(xué)改變之一是突觸脫失，其程度與癡呆嚴(yán)重程度平行。突觸素(synaptophysin，SYN)作為突觸前終末的特異性標(biāo)記物，可用來(lái)檢測(cè)突觸的密度和分布。我們首次采用海馬注射Aβ與ApoE4模擬AD的病理特征，并通過(guò)檢測(cè)SYN探索Aβ與ApoE4在AD發(fā)病機(jī)制中的作用及二者間是否存在協(xié)同作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠24只，體重200－300g，鼠齡60 d。腦立體定位儀購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Aβ1－40購(gòu)自中山生物工程有限公司。apoE4購(gòu)自英國(guó) Immunokontact公司。兔抗鼠突觸素單克隆抗體，二抗羊抗兔均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。MIAS－2000圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自四川大學(xué)智勝軟件股份有限公司。

1.2 分組

24只大鼠腹腔注射D－半乳糖6周后，用隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組:對(duì)照組雙側(cè)海馬注射生理鹽水，每側(cè)2 μl;Aβ 組雙側(cè)海馬注射5 μg/μl的 Aβ1－40，每側(cè)2μl;apoE4組雙側(cè)海馬注射0.5μg/μl的apoE4，每側(cè)2μl;Aβ+apoE4組雙側(cè)海馬注射每側(cè)10μg/μl Aβ1－401 μl+1 μg/μl apoE4 1 μl。

1.3 動(dòng)物模型制備

以顆粒型普通大鼠飼料(含蛋白質(zhì)23.00%、脂肪4.70%、鈉鹽0.24%)喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水，動(dòng)物房溫度控制在20℃左右，正常晝夜節(jié)律。首先予以腹腔注射D－半乳糖50 mg/(kg·d)6周致衰;之后海馬注射:10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，做顱頂正中切口，參照 George Paxinos的《The Rat Brain In Stereotaxic Cordinatcs》，在腦立體定位儀操縱下于前囟后3.0 mm分別向中線左右兩側(cè)旁開(kāi)2.0 mm處，牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，5μl微量注射器自顱骨表面垂直進(jìn)針4.0 mm，分別將生理鹽水、Aβ1－40、apoE4、Aβ1－40+apoE4混合液2 μl緩慢注入雙側(cè)海馬，術(shù)后保溫至清醒。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè)

水迷宮測(cè)試實(shí)驗(yàn):海馬注射15 d后進(jìn)行5 d定位航行試驗(yàn)。水池被平均分為4個(gè)象限，將大鼠面向池壁放入水中，記錄每次試驗(yàn)中大鼠從入水點(diǎn)到發(fā)現(xiàn)并爬上水下平臺(tái)的時(shí)間，為逃避潛伏期(escape latency，EL)。大鼠自由游泳最長(zhǎng)時(shí)限120 s，大鼠120 s內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，就將其置于平臺(tái)上10s，此時(shí)的EL記為120 s。每1只大鼠一個(gè)上午或下午進(jìn)行4次連續(xù)訓(xùn)練，每次訓(xùn)練間隔為60 s。1只大鼠1 d的EL的平均值就是平均逃避潛伏期(the average escape latency，AEL)。定位航行試驗(yàn)后撤除平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面壁投入水池，攝像機(jī)記錄其60 s內(nèi)水中游泳路徑，電腦分析計(jì)算大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.5 制備免疫組化切片

將大鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)下腔靜脈，同時(shí)快速灌注肝素化生理鹽水(50 U/ml)120 ml(滴速為10 ml/min)以清除血管內(nèi)血液，斷頭取腦，將大鼠海馬組織固定于4%的多聚甲醛溶液24 h后石蠟包埋，冠狀切片(厚度2－3μm)。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)突觸素的表達(dá)

取石蠟切片采用SABC法檢測(cè)抗體的表達(dá)，步驟如下:①切片脫蠟;②滅活內(nèi)源性酶;③熱抗原修復(fù);④滴加5%BSA封閉液;⑤滴加稀釋的一抗突觸素(1∶200);⑥滴加生物素標(biāo)記的相應(yīng)的二抗;⑦滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素－親和素復(fù)合物(SABC);⑧抗原染色;⑨復(fù)染;⑩樹(shù)膠封片。

用MIAS－2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定海馬CA1區(qū)SYN的OD值。同時(shí)測(cè)定相應(yīng)每張切片胼胝體OD值作背景，免疫反應(yīng)物的OD值減去背景OD值得到校正OD值(COD值)，即免疫反應(yīng)物的OD值。每例標(biāo)本測(cè)5張切片，每張切片的每個(gè)測(cè)定部位隨機(jī)選取三個(gè)視野，取平均值。所有OD值測(cè)定均在相同的光學(xué)條件下完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 定位航行試驗(yàn)

在5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠逃避潛伏期隨著游泳天數(shù)的增加有不斷縮短的趨勢(shì)(見(jiàn)表1，2)，表明各組大鼠在5 d的游泳訓(xùn)練中對(duì)尋找平臺(tái)均有一定的學(xué)習(xí)記憶能力。從第5天大鼠的游泳軌跡圖可以看出，對(duì)照組大鼠很快能找到平臺(tái)位置，apoE4組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡多位于平臺(tái)所在象限，而Aβ組、Aβ+apoE4組大鼠多圍繞池壁游泳，在迷宮外環(huán)停留時(shí)間較長(zhǎng)，較少游向平臺(tái)附近，其運(yùn)動(dòng)軌跡隨機(jī)分布于各象限中，以 Aβ+apoE4組更為明顯。apoE4組、Aβ組與對(duì)照組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Aβ組與apoE4組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Aβ與apoE4 之間存在交互作用(F=7.098，P＜0.01)，Aβ+apoE4組與Aβ組、apoE4組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，即二者具有協(xié)同作用。

表1 不同干預(yù)后大鼠第5天的逃避潛伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

表1 不同干預(yù)后大鼠第5天的逃避潛伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

不用43.50±9.78 10.75±2.44

表2 大鼠第5天的逃避潛伏期變化的析因設(shè)計(jì)方差分析Table 2 Variance analysis of escape latency after different intervention at 5 d

2.2 Aβ與apoE4對(duì)大鼠跨臺(tái)次數(shù)的影響

用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果顯示，apoE4組、Aβ組與對(duì)照組間比較，大鼠跨臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見(jiàn)表3，4)。Aβ組與apoE4組比較，大鼠跨臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Aβ與apoE4 之間存在交互作用(F=7.230，P＜0.01)，Aβ+apoE4組大鼠跨臺(tái)次數(shù)均明顯少于單用Aβ組及單用apoE4組，即二者具有協(xié)同作用。

表3 不同干預(yù)后大鼠的跨臺(tái)次數(shù)(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

表3 不同干預(yù)后大鼠的跨臺(tái)次數(shù)(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

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表4 大鼠跨臺(tái)次數(shù)變化的析因設(shè)計(jì)方差分析Table 4 Variance analysis of times of passing platform after different intervention

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)SYN OD值比較

apoE4和Aβ對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)SYN免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的光密度值下降的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見(jiàn)表5，6)，Aβ 與 apoE4 對(duì) SYN 光密度值下降具有交互作用(P＜0.05);表明單獨(dú)用Aβ或apoE4均可導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)CA1區(qū)SYN光密度值下降，并且兩者間存在交互作用。

表5 不同干預(yù)后大鼠海馬CA1區(qū)SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

表5 不同干預(yù)后大鼠海馬CA1區(qū)SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

不用0.551±0.032 0.759±0.043

表6 大鼠海馬CA1區(qū)SYN OD值析因設(shè)計(jì)方差分析Table 6 Variance analysis of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention

3 討論

Morris水迷宮可以檢測(cè)與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶的形成和維持，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)研究領(lǐng)域。我們采用Morris水迷宮測(cè)定各組大鼠學(xué)習(xí)能力發(fā)現(xiàn):apoE4組、Aβ組與對(duì)照組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、跨臺(tái)次數(shù)明顯減少;Aβ+apoE4組與Aβ組及apoE4組比較，平均潛伏期明顯延長(zhǎng)、跨臺(tái)次數(shù)明顯減少，可見(jiàn)雙側(cè)海馬注射apoE4、Aβ、Aβ+apoE4均可使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，而Aβ與apoE4對(duì)學(xué)習(xí)記憶的損害具有協(xié)同作用。

AD是一種老年性疾病，人或者動(dòng)物衰老時(shí)，智力水平及體內(nèi)物質(zhì)代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等均與年青時(shí)不同，因D－半乳糖長(zhǎng)期注射，可以引起機(jī)體脂質(zhì)氧化亢進(jìn)，腦功能減退，轉(zhuǎn)錄水平減低，神經(jīng)元RNA、蛋白總量下降，核固縮甚至神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，故本實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)期大量注射半乳糖的方法來(lái)代替自然衰老鼠。

海馬直接參與信息的儲(chǔ)存與回憶，存在兩個(gè)回路與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，一個(gè)是經(jīng)典的帕帕茲環(huán)路(Papez circle)，另一個(gè)是三突觸回路(trisynaptic circuit)。海馬→穹窿→乳頭體→乳頭丘腦束→丘腦前核→扣帶回→海馬，這條環(huán)路就是帕帕茲環(huán)路。三突觸回路即內(nèi)嗅皮層通過(guò)穿通纖維與齒狀回顆粒細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，而顆粒細(xì)胞發(fā)出苔狀纖維與CA3區(qū)錐體細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，再由CA3區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)出的Schaffer側(cè)支與CA1區(qū)錐體細(xì)胞形成突觸聯(lián)系。而CA1區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)出纖維出海馬至下托，由下托發(fā)出纖維返回內(nèi)嗅皮質(zhì)。近年來(lái)的研究證實(shí)，三突觸回路具有特殊的機(jī)能特性，與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)［2］。已有研究證實(shí)，AD患者海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)突觸素含量比正常人明顯減少［3］，故本實(shí)驗(yàn)采用海馬注射方法。

突觸是神經(jīng)元之間的連接點(diǎn)，是信息傳遞的基礎(chǔ)，多突觸連接形成神經(jīng)回路。SYN是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，其胞質(zhì)羧基末端可結(jié)合Ca2+，是突觸囊泡鈣結(jié)合蛋白之一，可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，對(duì)突觸囊泡的胞吐起重要作用［4］。SYN在神經(jīng)元核周體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基復(fù)合體進(jìn)行加工，在囊泡中被運(yùn)至突觸活化區(qū)，參與突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡再循環(huán)和突觸發(fā)生。除了突觸囊泡外，線粒體、胞膜、突觸后膜均無(wú)突觸素。突觸素的減少意味著突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱，傳遞效能減弱。

Aβ的神經(jīng)毒性作用已被證實(shí)。以往的研究表明，自然分泌的Aβ低聚物(oligomers)可以在生理水平明顯抑制大鼠海馬的突觸傳遞，提示可溶性Aβ低聚物可導(dǎo)致AD腦內(nèi)突觸功能障礙和突觸丟失。我們采用海馬注射可溶性Aβ，結(jié)果顯示海馬注射可溶性Aβ后動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能受損、大鼠海馬SYN OD值明顯下降。說(shuō)明可溶性Aβ可以導(dǎo)致AD的重要病理特征即突觸受損及主要的臨床表現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能受損。

apoE4對(duì)神經(jīng)元的影響報(bào)道不多，有研究表明ε4基因型的個(gè)體與非ε4基因型的個(gè)體相比較，更易出現(xiàn)額葉局部萎縮［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，單純apoE4即可致SYN OD值下降，突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱，傳遞效能減弱，從而使動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能受損。

我們通過(guò)在體Aβ聯(lián)合apoE4海馬注射的方法，并用析因設(shè)計(jì)方差分析證實(shí) Aβ與apoE4對(duì)SYN OD的影響具有協(xié)同作用，說(shuō)明apoE4有協(xié)同Aβ神經(jīng)毒性效應(yīng)的作用。這與細(xì)胞水平及國(guó)外研究相一致［6－8］。2000年郭文平等［6］在細(xì)胞水平的研究提示apoE4可能對(duì)Aβ神經(jīng)毒具有協(xié)同作用。Smach等［7］研究提示AD患者中攜帶apoE4基因者腦脊液中 Aβ的含量比未攜帶者更低。在 APPV717F+/－轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的研究也發(fā)現(xiàn)，apoE以亞型特異性方式促進(jìn)Aβ的沉積［8］。與apoE3個(gè)體相比較，apoE4的個(gè)體腦內(nèi)高水平的Aβ低聚物可使樹(shù)突減少，加重記憶損害，導(dǎo)致AD患者近記憶力下降［9］。推測(cè)apoE4促進(jìn)Aβ的沉積可能機(jī)制包括:①apoE4可以增加Aβ的形成［9］，使隨機(jī)螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)槠瑢咏Y(jié)構(gòu)，因而更易聚集成為纖維樣結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生淀粉樣斑塊。②apoE4與Aβ直接結(jié)合形成不易清除的復(fù)合物，能夠很強(qiáng)地穩(wěn)定Aβ低聚物，這種改變導(dǎo)致AD［10］。③通過(guò)細(xì)胞內(nèi)機(jī)制增加Aβ神經(jīng)毒性。Aβ聯(lián)合apoE4海馬注射后，使更多Aβ進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，促發(fā)一系列細(xì)胞毒性作用。

我們以海馬CA1區(qū)SYN作為檢測(cè)指標(biāo)，用Aβ聯(lián)合apoE4注射于致衰大鼠海馬，模擬出AD的病理改變—突觸脫失及臨床特征—學(xué)習(xí)記憶功能障礙，提示apoE4有協(xié)同Aβ神經(jīng)毒性效應(yīng)的作用，其具體的相互作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

［1］Hashimoto T，Serrano-Pozo A.Apolipoprotein E，Especially Apolipoprotein E4，increases the oligomerization of amyloid β peptide［J］.J Neurosci，2012;，10(32):15181－15192.

［2］Remondes M，Schuman EM.Molecular mechanisms contributing to long-lasting synaptic plasticity at the temporoammonic-CAIsynapse［J］.Learn Mem，2003，10(4):247－252.

［3］Guevara J，Dilhuydy H.Coexistence of reactive plasticity and neurodegeneration in Alzheimer diseased brains［J］.Histol Histopathol，2004，19:1075－1084.

［4］楊春.突觸素的若干研究［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2004，13(1):85－89.

［5］Honea RA，Swerdlow RH，Vidoni ED，etal.Progressive regional atrophy in normal adults with a maternal history of Alzheimer disease［J］.Neurology，2011，76(9):822－829.

［6］郭文平，周麗華，謝瑤，等.Aβ31－35和ApoE4對(duì)培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2001，17(3):261－264.

［7］Smach MA，Charfeddine B，Lammouchi T，etal.CSF beta－amyloid 1－42 and tau in Tunisian patients with Alzheimer’s disease:the effect of APOE epsilon4 allele［J］.Neurosci Lett，2008，440(2):145－149.

［8］Van Dooren T，Muyllaert D，Borghgraef P，etal.Neuronal or glial expression of human apolipoprotein e4 affects parenchymal and vascular amyloid pathology differentially in different brain regions of double-and triple-transgenic mice［J］.Am J Pathol，2006，168(1):245－260.

［9］Hashimoto T，Serrano-Pozo A，Hori Y，etal.Apolipoprotein E，especially apolipoprotein E4，increases the oligomerization of amyloid β peptide［J］.JNeurosci，2012，32(43):15181－15192.

［10］Cerf E，Gustot A，Goormaghtigh E，etal.High ability of apolipoprotein E4 to stabilize amyloid－β peptide oligomers，the pathological entities responsible for Alzheimer＇s disease［J］.FASEB J，2011，25(5):1585－1595.