楊珊珊，賈曉民，趙 杰，陳 忱

(徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院呼吸科，徐州 221006;*通訊作者，E-mail:13805206090@163.com)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是一種漸進性的肺部疾病，其病理改變主要以成纖維細胞灶的存在，成纖維細胞數目增多較顯著，肺纖維化的預后較差，一經診斷其中位生存時間僅3－4年［1］。百草枯(parquat，PQ)又名克蕪蹤，是一種劇毒的農藥，我國百草枯的用量很大。百草枯可經皮膚、消化道及呼吸道等吸收，在臨床上口服百草枯死亡率極高，僅極少數病患得以幸存［2］。因此，本研究組擬用百草枯建立小鼠肺纖維化模型，以便于研究其發(fā)病機制及藥物學反應等，為臨床上找出有效的救治方法提供可能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級KM小鼠、ICR小鼠及C57BL/6J小鼠各36只，均為雄性，6－8周齡，體重(25±3)g，購于徐州醫(yī)學院實驗動物中心，飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中。

1.2 主要試劑及儀器

98%百草枯粉劑(PQ)(粉劑，1 g裝，購自上海農藥研究所)，Masson染色試劑盒及羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，OLYPUMS顯微鏡等。

1.3 方法

將三個品系小鼠按照隨機數字表法分為模型組及對照組。其中模型組又分為10 mg/kg組及20 mg/kg組(n=12)。模型組小鼠按體重10 mg/kg及20 mg/kg稱取準確劑量藥物后溶于0.5 ml生理鹽水中，后小鼠腹腔內注射給藥;對照組給予0.5 ml生理鹽水腹腔內注入。

觀察并記錄小鼠的行為學及體重等的變化，死亡小鼠不納入統(tǒng)計。存活動物均于用藥后28 d采用腹主動脈放血法處死，取出肺組織，PBS沖洗后用濾紙吸取肺組織表面水分，取部分左肺組織于4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色及Masson染色觀察肺組織膠原纖維沉積狀況。堿水解法測定剩余左肺組織羥脯氨酸含量。

1.4 肺組織羥脯氨酸測定

嚴格按照試劑盒說明書操作，采用堿水解法測定羥脯氨酸含量(HYP)［3］。

1.5 肺泡炎癥及肺纖維化程度的判斷

在光學顯鏡微下觀察肺組織的病理變化，并根據Szapiel等［4］提出肺泡炎和肺纖維化的分級法進行評分(見表1)。

表1 肺泡炎及肺纖維化評分表Table 1 The score of alveolitis and pulmonary fibrosis

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數據處理和分析，所有檢測數據均以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)，進行方差齊性檢驗，方差齊采用LSD法進行組間比較，方差不齊采用Welch法和Brown－Forsythe法進行校正，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

3個品系的對照組小鼠均表現為體重增加，被毛有光澤，精神狀態(tài)良好，飲食及飲水正常。

KM小鼠模型組:10 mg/kg組用藥后即出現精神不振，活動度下降等現象，但在用藥后2 d即恢復正常;20 mg/kg組用藥后小鼠出現全身抖動，瞇眼，眼中含淚，并且活動度明顯下降，后肢行走不穩(wěn)，呈蹣跚步態(tài)，易歪倒。小鼠進食及進水量明顯減少，第3天開始即出現老鼠死亡，死亡時小鼠全身抽搐，歪倒，前爪抱起，后肢伸直，張嘴呼吸。

ICR小鼠模型組:10 mg/kg組用藥后未出現明顯的行為學異常。20mg/kg組小鼠均出現活動度下降，精神萎靡，全身抖動及瞇眼等現象，且小鼠均有一定程度的體重下降，進食進水量減少等。用藥后當天下午開始出現老鼠死亡現象且全身抖動等癥狀，嚴重的小鼠3 d內全部死亡。

C57BL/6J小鼠模型組:10 mg/kg組用藥后前3 d均無異常表現，其中2只老鼠從第9天起開始出現明顯的體重下降，精神萎靡等現象，其中一只老鼠當天死亡，另一只老鼠體重繼續(xù)下降至第13天時體重開始回升，并逐漸恢復至正常水平。20mg/kg組小鼠從第4天起開始出現拱背，瞇眼，體重下降及活動度下降等現象，出現此現象的老鼠均于2 d內死亡。

2.2 小鼠存活例數

三個品系對照組均未見小鼠死亡。KM小鼠及ICR小鼠10 mg/kg組未出現小鼠死亡，而C57BL/6J小鼠10 mg/kg組自第9天開始出現小鼠死亡，約從第14天起狀態(tài)穩(wěn)定，未再有死亡現象出現;三個品系20 mg/kg組均有小鼠死亡，ICR小鼠及C57BL/6J小鼠在用藥后4－7 d內死亡較多，后趨于穩(wěn)定。

2.3 小鼠體重變化趨勢

C57BL/6J小鼠自建模后當日即出現體重下降，約14 d時體重降至最低后又緩慢回升，但仍不能恢復至正常水平。ICR小鼠體重自建模后即開始下降，但體重下降不明顯，一直在正常范圍內波動。KM小鼠體重在7 d內略有下降，后逐漸上升，且體重增加明顯高于原水平(圖1)。

表2 各組小鼠存活只數 (只)Table 2 The number of survival mice in model group of three strains (cases)

圖1 三個品系小鼠模型組的體重變化曲線Figure 1 The changes of body weight in three model groups

圖2 各組小鼠肺組織病理學變化 (HE，×400)Figure 2 Morphology of lung tissue in three strains of mice after treament under a microscope by HE staining (×400)

圖3 各組小鼠肺組織膠原纖維改變 (Masson，×400)Figure 3 The changes of collagen in lung tissue in three strains of mice after treament under a microscope by Masson staining(×400)

2.4 小鼠肺組織羥脯氨酸含量的變化

三個品系小鼠模型組羥脯氨酸含量均高于對照組(P＜0.01)，且C57BL/6J小鼠模型組羥脯氨酸含量最高(P＜0.01)，ICR及KM小鼠模型組間羥脯氨酸差異無統(tǒng)計學意義(見表3)。

表3 各組小鼠羥脯氨酸含量(±s，n=8)Table 3 The content of hydroxyproline in three strains of mice(±s，n=8)

表3 各組小鼠羥脯氨酸含量(±s，n=8)Table 3 The content of hydroxyproline in three strains of mice(±s，n=8)

與對照組相比，*P＜0.01;與 10 mg/kg組相比，#P＜0.01;與KM小鼠及ICR小鼠比，☆P＜0.01

組20 mg/kg組 24.56±0.55* 24.32±0.42*# 28.87±0.20＊☆

2.5 小鼠肺組織的病理改變及評分

HE染色結果顯示:三個品系小鼠對照組肺泡結構基本正常，KM模型組小鼠肺組織僅見肺泡腔變形，炎癥細胞浸潤，未見明顯膠原纖維聚集;ICR模型組小鼠肺組織可見肺泡變形嚴重，但肺泡腔結構仍然存在，未見片狀膠原纖維;而C57BL/6J 10 mg/kg組小鼠可見粉紅色的膠原纖維，20 mg/kg組可見片狀的膠原纖維細胞，肺泡腔結構消失(圖2，見第547頁)。Masson染色結果可見(藍色區(qū)域為膠原纖維):對照組僅于氣管或血管周圍極少量纖維藍染，KM模型組可見氣管旁少許膠原纖維沉積;ICR模型組可見肺泡間隔少許膠原纖維沉積，藍染區(qū)域較KM小鼠稍有增加;C57模型組可見廣泛的藍染區(qū)域，肺泡腔結構消失(圖3，見第547頁)。

三個品系小鼠，只有C57BL/6J小鼠20 mg/kg組肺纖維化評分與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，見表4)。

表4 不同品系小鼠百草枯肺纖維化評分表(n=8，±s)Table 4 The score of pulmonary fibrosis in the three strains of mice(n=8，±s)

表4 不同品系小鼠百草枯肺纖維化評分表(n=8，±s)Table 4 The score of pulmonary fibrosis in the three strains of mice(n=8，±s)

與對照組相比，#P＜0.05

ICR小鼠對照組 8 0 0 0 0.00±0.00 10 mg/kg組 7 1 0 0 0.125±0.35 20 mg/kg組 5 2 1 0 0.50±0.76 C57BL/6J小鼠對照組 8 0 0 0 0.00±0.00 10 mg/kg組 6 1 1 0 0.38±0.74 20 mg/kg 組 3 3 1 1 1.0±0.74#

3 討論

我國是農業(yè)大國，百草枯作為除草劑在我國的用量極大，因而每年都有較多的百草枯中毒病例出現，百草枯中毒后早期易出現急性肺損傷及多器官功能衰竭，即使早期幸存，患者在數周內即會發(fā)生嚴重的肺間質纖維化，最終死亡［5］。百草枯中毒后死亡率極高，目前我國仍鮮有百草枯中毒后存活病例的報道，其中后期的肺間質纖維化是導致死亡的重要原因，目前對肺間質纖維化的治療仍處于研究階段［6－8］，因此本實驗建立百草枯小鼠的肺纖維化模型，為臨床研究百草枯中毒提供成熟的模型。

本研究通過對不同品系的小鼠一次性腹腔內注射百草枯制作肺纖維化模型。有文獻報道，不同給藥途徑給予小鼠百草枯均可誘導動物纖維化模型的形成［9－11］。早期研究顯示，百草枯小鼠多在建模后3－5 d內死亡，20 mg/kg ICR小鼠全身抖動、走路蹣跚及進食量下降明顯者在3 d內均死亡。但KM及C57BL/6J小鼠在3－7 d內死亡，與報道相符［12］。

百草枯可以導致肺泡上皮變性，細胞基底膜局灶性破壞，肺泡腔間質細胞增生，細胞內纖維變性，膠原沉積。通過Masson膠原染色即可分辨出膠原沉積范圍及肺間質纖維化的程度。本實驗結果顯示，在相同劑量的百草枯作用下，肺纖維化程度在C57BL/6J小鼠模型組中相對較重且廣泛，但癥狀出現較遲緩;而KM及ICR小鼠纖維化程度較輕，KM小鼠最輕，且死亡率低于ICR及C57BL/6J小鼠。

羥脯氨酸是膠原纖維中所獨有的一種氨基酸，在其他蛋白中其含量甚微，羥脯氨酸含量是反應膠原蛋白變化的敏感指標，測定肺組織羥脯氨酸含量即可反映出肺纖維化的程度［13］。本實驗結果顯示各模型組的羥脯氨酸含量均高于對照組，其中以C57BL/6J 20 mg/kg組含量最高，表明C57BL/6J小鼠20 mg/kg組其纖維化程度最重，但仍未達到彌漫性分布的纖維化水平。

KM小鼠抗病力和適應力很強，繁殖率和成活率極高，其廣泛應用于藥理學、毒理學等領域的研究及藥品、生物制品的生產與檢定。ICR小鼠的外周血及骨髓細胞具有較好的穩(wěn)定性，是良好的血液學和免疫藥物試驗，復制病理模型較常用的實驗動物。C57BL/6J小鼠對放射有抵抗力，對結核桿菌敏感，對鼠痘病毒有一定的抵抗力，對百日咳易感因子敏感，嗜酒精性高，是研究腫瘤學、遺傳學的常用品系。三種小鼠均可復制出肺纖維化小鼠模型，但C57BL/6J小鼠對百草枯更加敏感［9，14］，因此主要應用此鼠建立百草枯肺損傷模型。本研究結果顯示C57BL/6J小鼠的羥脯氨酸含量最高，病理改變最重，說明C57BL/6J小鼠與其余兩系小鼠相比更容易復制出肺纖維化模型，但是小鼠的死亡率仍較高。因此應用百草枯一次性腹腔內注射建立肺纖維化模型的劑量尚待進一步的研究，既要保證建模的成功，又要最大程度地減少死亡率。

本研究結果顯示，KM及ICR小鼠均未能成功建立百草枯肺纖維化模型，僅C57BL/6J小鼠部分區(qū)域出現肺纖維化，因此C57BL/6J小鼠更適宜建立肺纖維化模型。

［1］Meltzer EB，Noble PW.Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Orphanet JRare Dis，2008，3:8.

［2］Xu XL，Wang W，Song ZJ，etal.Imaging in detecting sites of pulmonary fibrosis induced by paraquat［J］.World J Emerg Med，2011，2(1):45－49.

［3］Zhu T，Jin H，Xiao M，etal.Protective role of andrographolide in bleomycin－induced pulmonary fibrosis in mice［J］.Int J Mol Sci，2013，14(12):23581－23596.

［4］Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，etal.Bleomycin－induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］.Am Rev Respir Dis，1979，120(4):893－899.

［5］Weng CH，Hu CC，Lin JL，etal.Predictors of acute respiratory Distress syndrome in patients with paraquat intoxication［J］.PLoS One，8(12):e82695.

［6］Tzouveleskis A，Bouros D.An acid treatment for idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet Respir Med，2013，1(5):348－389.

［7］Tzouveleskis A，Ntolios P，Bouros D.Stem cell treatment for chronic lung disease［J］.Respiration，2013，85(3):179－192.

［8］He X，Wang L，Szklarz G，etal.Resveratrol inhibits paraquatinduced oxidative stress and fibrogenic response by activating the nuclear factor erythroid 2－related factor 2 pathway［J］.J Pharmacol Exp Ther，2012，342(1):81－90.

［9］董雪松，劉盛業(yè)，劉偉，等.腹腔一次注射法構建百草枯致小鼠肺間質纖維化模型［J］.中國實驗動物學報，2011，19(4):81－83.

［10］李軍偉，沈秀徽，孫未，等.吡非尼酮抗百草枯中毒小鼠肺纖維化的研究［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2011，29(2):87－93.

［11］陳麗，錢潔，葉延，等.百草枯反復小劑量腹腔給藥誘導小鼠肺纖維化模型［J］.中華急診醫(yī)學雜志，2011，20(12):1285－1289.

［12］Novaes RD，Goncalves RV，Cupertino MC，etal.Bark extract of Bathysa cuspidata attenuates extra－pulmonary acute lung injury induced by paraquat and reduces mortality in rats［J］.Int J Exp Pathol，2012，93(3):225－233.

［13］Liu H，Xue JX，Li X，etal.Quercetin liposomes protect against radiation－induced pulmonary injury in a murine model［J］.Oncol Lett，2013，6(2):453－459.

14］Jiao Y，Smeyne RJ，Lu L，etal.Genetic dissection of strain dependent paraquat induced neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta［J］.PLOSOne，2012，7(1):e29447.