程紅兵，陳云霞，張雄鷹，趙良啟，曹艷芳

(1長治醫(yī)學院微生物學教研室，長治 046000;2山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室;3長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院;*通訊作者，E-mail:liangqi@sxu.edu.cn)

多糖是一類醛糖或酮糖組成的生物高分子，可以傳遞細胞之間大量的生物信息，在應用研究上，對多糖分子進行適當?shù)姆肿有揎椇徒Y(jié)構(gòu)改造，使其具有更多的生物活性或強化已有的生物活性，能更廣泛地應用于臨床［1，2］。多糖的硫酸酯化是多糖結(jié)構(gòu)修飾的研究熱點，實驗表明硫酸酯化多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等作用。

本實驗室獲得一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，能產(chǎn)生豐富的胞外多糖(REPS)［3，4］。本研究采用氯磺酸－吡啶法對REPS進行硫酸酯化修飾，得到硫酸酯化胞外多糖(sulfated rhizobium exopolysaccharide，SREPS)，觀察SREPS的抑瘤作用，以探討其抗腫瘤的作用機制，為臨床治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株

昆明種小鼠，體重(20±2)g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。小鼠肝癌細胞株(H22)，由山西省腫瘤醫(yī)院實驗動物中心提供，本室以腹水型傳代保種。

1.2 藥物

Rhizobium sp.N613 胞外多糖(REPS)，由本實驗室以Rhizobium sp.N613為生產(chǎn)菌株發(fā)酵純化制得，分子量為37.52 kD。利用氯磺酸－吡啶法對REPS進行硫酸酯化修飾，獲得SREPS。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 試劑和儀器

生理鹽水(山東康寧藥業(yè)有限公司)。日立U－2010紫外分光光度計(日本日立公司)，恒溫振蕩器(太倉市科學儀器有限公司)，電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 急性毒性實驗

選取健康昆明種小鼠，雌雄各半，每組10只，陰性對照組、4個實驗組分別采用蒸餾水、SREPS1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg 和 10.00 g/kg 灌胃。灌胃前各組小鼠均禁食16 h，灌胃后12 h喂食，飼養(yǎng)觀察10 d。記錄動物死亡數(shù)目、體重增長和進食等情況，確定SREPS的半數(shù)致死量(LD50)。

1.5 SREPS對小鼠H22的抑制作用

抽取腹腔接種H22細胞8－10 d的小鼠腹水，用無菌生理鹽水稀釋成細胞數(shù)為1×106ml的瘤細胞懸液，選70只小鼠，每只小鼠于右前肢腋皮下接種0.2 ml。次日隨機分7組，每組10只，雌雄兼用且分養(yǎng)。SREPS 用無菌水配制為 0.5，1，2.5，5，10 mg/kg溶液，接種后24 h腹腔注射給藥，模型組腹腔注射生理鹽水，陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)，每日一次，每次均 0.4 ml，連續(xù)給藥 10 d。于末次給藥后24 h，小鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，摘取脾臟和胸腺，稱重，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。腫瘤抑制率(%)=(荷瘤對照組平均瘤重－實驗組平均瘤重)/荷瘤對照組平均瘤重×100%

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行組間方差檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實驗

給藥后小鼠行為活動、食欲、毛色等均正常，體重與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1)，未見有藥物引起的病變和中毒現(xiàn)象，實驗過程小鼠無死亡，說明SREPS的LD50＞10 g/kg。按照我國五級急性毒性分級標準，SREPS屬于微毒物質(zhì)，對實驗動物無急性毒性作用。

表1 急性毒性實驗結(jié)果Table 1 Results of the acute toxicity test

2.2 對小鼠H22肉瘤的抑制作用

SREPS各劑量組對小鼠H22肉瘤均有一定抑制作用，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01，見表2)，其中 SREPS 以劑量為 2.5 mg/kg 的抑瘤率最高，達34.90%。雖然環(huán)磷酰胺組的抑瘤率最高，達到49.40%，但該組小鼠體重的增加值顯著小于其他各組，可能是由于其強烈的毒副作用所致。而SREPS各劑量組對小鼠的體重增加無明顯影響。該試驗結(jié)果表明，各劑量組SREPS對小鼠肉瘤H22肉瘤均有良好的抑瘤作用，且具有良好的生物相容性。

表2 SREPS對H22荷瘤小鼠瘤體生長的影響Table 2 Effects of SREPS on tumor weight in H22 tumor-bearing mice

2.3 對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

從表3中可以看出，環(huán)磷酰胺組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而SREPS各劑量組較模型組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)升高，其中2.5 mg/kg劑量組對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均有作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明各劑量組SREPS對荷瘤小鼠胸腺和脾有保護作用。

表3 SREPS對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響Table 3 Effects of SREPS on thymus index and spleen index in H22 tumor－bearing mice

3 討論

硫酸酯化多糖是指含硫酸基團的天然及半合成的多糖，為聚陰離子化合物。近年來發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖具有抑制艾滋病病毒的活性［5］，使硫酸酯化多糖的研究成為熱點。繼而研究發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖還具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力等活性［6－8］。本實驗室從一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)發(fā)酵液中提取分離胞外多糖(REPS)，采用氯磺酸－吡啶法對REPS進行硫酸酯化修飾，得到硫酸酯化 REPS(SREPS)。本試驗結(jié)果顯示，小鼠對 SREPS的LD50＞10 g/kg，表明SREPS為低毒物質(zhì)。各劑量組SREPS對荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤增長均具有一定的抑制作用，其中SREPS以劑量為2.5 mg/kg的抑瘤率最高，達34.90%。雖然環(huán)磷酰胺組的抑瘤率最高，但環(huán)磷酰胺在抑制腫瘤的同時對荷瘤小鼠的體重有一定的影響，對小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均有顯著的抑制，說明環(huán)磷酰胺可能導致脾和胸腺萎縮，進而導致荷瘤小鼠免疫功能低下，長期使用該藥物對機體有較大的損害。而各劑量組SREPS對荷瘤小鼠的體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均無明顯影響，且2.5 mg/kg劑量組對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)有顯著升高。表明各劑量組SREPS在抑制腫瘤的同時對荷瘤小鼠的免疫功能無影響，有些劑量還可促進其免疫功能增強。從胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的變化情況來看，該硫酸酯化多糖制劑可能是通過增強機體自身的免疫力來達到抑瘤效果的。

SREPS作為一類天然半合成制劑，對肝癌H22小鼠有一定的抑瘤作用。其作用機制尚不清楚，還有待進一步研究。

［1］Zhao LQ，Chen YL，Ren S，etal.Studies on the chemical structure and antitumor activity of an exopolysaccharide from Rhizobium sp.N613［J］.Carbohydr Res，2010，345(5):637－643.

［2］Tao YZ，Zhang YY，Zhang LN.Chemical modification and antitumor activities of two polysaccharide－protein complexes from Pleurotus tuber－regium［J］.Int JBiol Macromol，2009，45(2):109－115.

［3］程紅兵，韓勇，任盛，等.Rhizobium sp.N613胞外多糖分離純化及抗S180肉瘤的研究［J］.中國藥學雜志，2008，43(3):268－272.

［4］程紅兵，任盛，謝紅，等.細菌胞外多糖提取優(yōu)化及毒性試驗研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28(3):74－78.

［5］Esteves AI，Nicolai M，Humanes M，etal.Sulfated polysaccharides in marine sponges:extraction methods and anti－HIV activity［J］.Mar Drugs，2011，9(1):139－153.

［6］Ngo DH，Kim SK.Sulfated polysaccharides as bioactive agents from marine algae［J］.Int JBiol Macromol，2013，62:70－75.

［7］Talarico LB，Zibetti RG，F(xiàn)aria PC，etal.Anti-herpes simplex virus activity of sulfated galactans from the red seaweeds Gymnogongrus griffithsiae and Cryptonemia crenulata［J］.Int J Biol Macromol，2004，34(1－2):63－71.

［8］Chen Y，Xiong W，Zeng L，etal.Bush Sophora Root polysaccharide and its sulfate can scavenge free radicals resulted from duck virus hepatitis［J］.Int JBiol Macromol，2014，66:186－193.