趙鵬,孫偉紅,魏曉芳,卜曉翠,高岱清

（青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042；#青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬心血管病醫(yī)院）

多西環(huán)素(doxycycline)是一種常用的半合成四環(huán)素類抗生素，通過抑制細(xì)菌的蛋白合成發(fā)揮殺菌作用。也有報(bào)道多西環(huán)素除抗菌作用外，在治療實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、恙蟲病和脊髓損傷過程中也具有一定療效[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素的治療作用與抗炎作用有關(guān)，后者可抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增值，減少小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[6,7]。但是目前關(guān)于多西環(huán)素具體的抗炎機(jī)制尤其對(duì)于適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)作用還不清楚。

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是一種體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，其既可啟動(dòng)適應(yīng)性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，也可誘導(dǎo)中樞和外周耐受。而多西環(huán)素對(duì)DC 分化成熟和功能方面的研究已有報(bào)道。因此，我們?cè)贒C 培養(yǎng)條件下加入多西環(huán)素，觀察多西環(huán)素對(duì)DC表型和功能的影響，以揭示多西環(huán)素的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 重組人IL-4 和GM-CSF 購自R&D 公司，1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自PAA 公司，LPS 購自Sigma 公司，抗CD83、CD80 和HLA-DR 熒光抗體購自BD 公司，抗CD3 標(biāo)記磁珠購自Miltenyi Biotec 公司，MACS 分離柱購自Miltenyi Biotec。

1.1.2 儀器CO2 培養(yǎng)箱（上海力康），RT-6000 酶標(biāo)儀（雷杜公司），倒置顯微鏡（日本olympus），F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單核細(xì)胞來源的DC 的誘導(dǎo)Ficoll不連續(xù)密度梯度離心法分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)細(xì)胞加入rhIL-4(500 U/mL)及rhGMCSF(500 U/mL)誘導(dǎo)向DC 分化，在37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng)5 天后，用LPS(1μg/mL)誘導(dǎo)成熟。對(duì)照組只加IL-4 和GM-CSF 培養(yǎng)5 天，1μg/mLLPS 培養(yǎng)2天后誘導(dǎo)成熟。處理組IL-4 和GM-CSF 培養(yǎng)5 天后，分別加入100 ng/mL 和300 ng/mL 的多西環(huán)素同LPS一起培養(yǎng)兩天。

1.2.2 流式檢測(cè) 分別取各組細(xì)胞，用PBS 洗兩次，調(diào)整細(xì)胞密度1 ×106 個(gè)/mL，100μL 重懸細(xì)胞，按照試劑盒說明分別用FITC 標(biāo)記的CD83、CD80 和HLADR 標(biāo)記各組細(xì)胞，震蕩均勻，室溫避光放置20 min，1 200 rpm 離心5 min，棄上清，加入2mL PBS，1 200 rpm 離心5 min，棄上清，加入400μLPBS，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 ELISA 加0.1 mL 離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于反應(yīng)孔中，置37℃孵育60 min。然后洗板5 次。同時(shí)設(shè)有空白孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔。在各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 mL，37℃孵育1小時(shí)，洗板5 次。加酶結(jié)合工作液0.1 mL，37℃避光孵育30 min，洗板5 次。加入0.1 mL 顯色底物液，37℃避光孵育15 min 后，于各反應(yīng)孔中加入終止液0.1 mL，混勻后10 min 內(nèi)測(cè)量OD 值。

1.2.4 T 細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn) 用抗CD3 標(biāo)記磁珠(Miltenyi Biotec)和MACS 分離柱(Miltenyi Biotec)，通過免疫磁珠陽性選擇從單個(gè)核細(xì)胞中分離T 細(xì)胞，各組DCs與CD3+T 細(xì)胞以1:20 比例共培養(yǎng)96 h。在終止培養(yǎng)前16 h 每孔加入10μL3H-TdR，通過閃爍記數(shù)儀中測(cè)定每個(gè)樣品的每分鐘脈沖數(shù)，并計(jì)算其增值數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 多西環(huán)素對(duì)樹突狀細(xì)胞形態(tài)和表型的影響 如圖1,細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,培養(yǎng)至第7 天后,可見對(duì)照組和處理組具有典型DC 細(xì)胞的特征,細(xì)胞體積明顯增大,表面可見細(xì)小的毛刺狀突起，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大劑量多西環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡沒有顯著差異。收集培養(yǎng)7 d 的各組細(xì)胞，通過流式檢測(cè)100 ng/mL 和300 ng/mL 多西環(huán)素處理組DC 表面HLA-DR 表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯下調(diào)，而各組DC 表面表達(dá)CD83 和CD80 無顯著差異。

圖1 多西環(huán)素對(duì)DC 表型的影響

2.2 多西環(huán)素對(duì)DC 細(xì)胞因子分泌的影響 收集各組DC 的培養(yǎng)上清ELISA 檢測(cè)(圖2),發(fā)現(xiàn)100 ng/mL和300ng/mL 多西環(huán)素處理組IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12 分泌較對(duì)照組明顯下調(diào)，且隨著劑量增加細(xì)胞因子分泌減少，而對(duì)IL-10 分泌無影響。

圖2 多西環(huán)素抑制DC 分泌IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12

2.3 DC 對(duì)異基因淋巴細(xì)胞的增殖的作用 收集培養(yǎng)第7 天的各組DC 作為刺激細(xì)胞,與同種型外周血T 細(xì)胞混合培養(yǎng)。如圖3,結(jié)果顯示100 ng/mL 和300 ng/mL 多西環(huán)素處理組誘導(dǎo)同型T 細(xì)胞增殖的能力顯著低于對(duì)照組，且隨著多西環(huán)素劑量增加刺激T 細(xì)胞增殖的能力變?nèi)酢?/p>

圖3 多西環(huán)素抑制DC 誘導(dǎo)的異基因淋巴細(xì)胞的增殖

3 討論

多西環(huán)素是一種抗生素，其也是一種抗炎藥物。多西環(huán)素的抗炎作用源于其抑制金屬蛋白酶的表達(dá)[4]，近來研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-8 等炎癥介質(zhì)[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素能誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡。而目前關(guān)于多西環(huán)素對(duì)DC 分化成熟和功能影響的研究很少。

實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化癥、恙蟲病感染和脊髓損傷與T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)有關(guān)[9,10]。而樹突狀細(xì)胞作為一種抗原遞呈細(xì)胞，在啟動(dòng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11,12]。DC 為T 細(xì)胞活化提供三個(gè)信號(hào)，除為T 細(xì)胞提供抗原肽:MHC 分子復(fù)合物這一抗原信號(hào)外，還表達(dá)高水平輔助刺激分子HLA-DR、CD80 和CD86，為T 細(xì)胞提供充足第二信號(hào)。此外，DC 也分泌IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)，而分泌IL-10 抑制免疫反應(yīng)。本研究我們發(fā)現(xiàn)100 ng/mL 和300 ng/mL 多西環(huán)素處理組DC 較對(duì)照組HLA-DR 的表達(dá)明顯下調(diào)，而CD83 和CD80 的表達(dá)無顯著差異。兩多西環(huán)素處理組DC 較對(duì)照組分泌IL-6、TNF-α和IL-12 顯著減少，刺激T 細(xì)胞增殖的能力降低，且具有劑量依賴性。這些結(jié)果表明多西環(huán)素可通過影響DC 的分化成熟、細(xì)胞因子分泌和刺激T 細(xì)胞增值能力而發(fā)揮抗炎作用。

本研究證實(shí)了多西環(huán)素可通過影響DC 的抗原遞呈能力、細(xì)胞因子的分泌、刺激T 細(xì)胞增殖能力而發(fā)揮抗炎作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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