（青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042）

乳腺癌是是女性中最常見的腫瘤，在歐美等發(fā)達國家占女性惡性腫瘤的第一位。在中國近幾年來乳腺癌發(fā)病率迅速上升。統(tǒng)計表明，上海等大城市乳腺癌發(fā)病率已占女性惡性腫瘤的第一位。盡管乳腺癌診斷和治療已有了很大的進步，但是乳腺癌的復發(fā)和轉移率依然很高，特別是人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)陽性(HER2+)的乳腺癌更容易復發(fā)和轉移。樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現的功能最強的專職抗原遞呈細胞(APC),在誘導和維持免疫應答中起重要作用。DC 提供共刺激分子和細胞因子給T 細胞使其充分的活化。另外研究表明[1-4]，腫瘤浸潤DC 與延長惡性腫瘤患者生存期、減少腫瘤復發(fā)相關。但是在惡性黑色素瘤患者體內腫瘤浸潤DC 存在著表型和功能缺陷，這種缺陷和腫瘤的惡化正相關[5-6]。為了探討HER2+乳腺癌細胞對患者免疫功能的影響，我們用HER2+MCF-7 培養(yǎng)上清模擬腫瘤微環(huán)境，體外觀察腫瘤細胞對樹突狀細胞表面分子及功能的影響。我們的結果表明，腫瘤上清處理的DC 除了共刺激分子和相關細胞因子分泌增加外，還增強了刺激同源異體T 細胞增殖及分泌細胞因子的能力。

1 材料與方法

1.1 材料 HER2+MCF-7 細胞株由美國加州大學李健健教授友情贈送,常規(guī)傳代培養(yǎng)。RPMI-1640（PAA）。rhGM-CSF（廈門特寶生物工程股份有限公司）和rhIL-4（Miltenyi Biotec），rhIL-2（山東泉港藥業(yè)有限公司）。FITC 或PE 標記的單克隆流式抗體：CD80、CD86、CD40、CD83 和HLA-DR（BD Pharmingen,San Diego,CA)。IL-12、TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γELISA 檢測試劑盒（上海森雄科技有限公司）。DC 分離試劑盒和CD3+T 細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotech,BergischGladbach,Germany)。流式細胞儀(FACSCalibur;BDBioscience)。

1.2 方法

1.2.1 DC 的體外誘導 取健康志愿者外周血10 mL常規(guī)分離獲得單個核細胞，懸?。芏葹? ×109/L）后，加入24 孔板（每孔1 mL），37℃、5%CO2 培養(yǎng)2 h后吸棄培養(yǎng)上清和洗滌去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的細胞。每孔加入含IL-4(500 U/mL)、rhGM-CSF(1000 U/mL)的完全培養(yǎng)基1 mL 誘導培養(yǎng)。1 ×107MCF-7 細胞種植在10 mm 的培養(yǎng)皿中，終體積10 mL，24 小時后收集上清。DC 培養(yǎng)到第5 天，加入腫瘤上清，同體積的完全培養(yǎng)基做對照組。DC 培養(yǎng)的第6 天，一部分用TNF-α(20 ng/mL，R&D System)誘導成熟，一部分磁珠純化，用作細胞因子檢測。24小時后收集各組誘導成熟的DC，檢測細胞表面標志。

1.2.2 DC 表型分子的檢測 收集經誘導培養(yǎng)7 天的DC 細胞，洗滌細胞,并調整細胞密度為1 ×109/L,各取100μL 細胞懸液加入到離心管中，每管內分別加入PE 或FITC 標記的抗人CD80、CD83、CD86、CD40、HLA-DR 單克隆抗體各20μL,室溫避光作用30 min后,用PBS 液洗細胞2 次。將細胞懸于PBS 液中,用流式細胞儀檢測細胞表面標志的表達。重復上述步驟共3 次。

1.2.3 DC 來源的細胞因子檢測 純化的DC 調整細胞密度2 ×105/mL，種植到96 孔板，每孔0.2 mL，TNF-α誘導成熟。24 小時后收集上清100μL，ELISA 檢測IL-12、TNF-α、IL-6 的分泌水平。

1.3 混合淋巴細胞培養(yǎng) 采用改良的MTT 比色法。收集實驗組和對照組純化的、30GX 線(Gammacell 40 Exactor;MDS Nordion International,Inc.,Ottawa,Ontario,CA)照射的DC,分別與分離純化的同種異體的CD3+T 細胞以（DC/T）1:20、1:100、1:500 比例混合后置96 孔板培養(yǎng)共培養(yǎng)72 h。一部分于培養(yǎng)結束前4 h,每孔加入5 g/L 的MTT 20μL,培養(yǎng)終止時,再在每孔加入100μL SDS-DMF 溶解液,過夜。待細胞形成的MTT 結晶完全溶解后,用酶標儀在波長570 nm 和630 nm 檢測各孔的A 值,結果以8 孔的A570-A630的平均值表示。一部分于培養(yǎng)結束時收集上清100 μL，ELISA 檢測TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ。實驗嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以“均數±標準差”表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 HER2+MCF-7 細胞誘導的DC 共刺激分子表達 培養(yǎng)至第5 天的DC 在腫瘤上清液誘導48 小時后,檢測細胞表型分子表達情況，結果如表1。肝素組表達CD40、CD80、CD86 及CD83 分子水平高于無上清液組(P＜0.05)，HLA-DR 的表達兩組間無差異。

2.2 HER2+MCF-7 細胞上清對DC 分泌IL-12、TNF-α、IL-6 和IL-10 的影響 除了共刺激分子，DC 分泌的細胞因子在激發(fā)T 細胞應答中也起重要作用。如表2所示，ELISA 檢測結果顯示，純化的、上清誘導的DC 分泌IL-12、TNF-α、IL-6 的水平明顯高于對照組。而IL-10 的分泌量顯著低于對照組。

2.3 腫瘤上清誘導的DS 刺激同種異體T 細胞增殖的能力 為了證實腫瘤上清誘導的DS 對T 細胞的刺激作用，純化的異體CD3+T 細胞與DS 按不同的比例混合培養(yǎng)，結果如圖1顯示：當DC/T 比是1:20、1:100時T 細胞的增殖能力明顯增加，腫瘤細胞促進了DCs對T 細胞的刺激能力。

表1 腫瘤上清誘導的DCs 第7 天表面分子的表達情況(x-±s)

表2 腫瘤上清誘導的DCs 分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10 量(pg/ml，±s)

表2 腫瘤上清誘導的DCs 分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10 量(pg/ml，±s)

注：與對照組比較,▲P<0.01，*P<0.05。MCF-7 組：腫瘤細胞上清液處理組。

組別 n IL-12 TNF-α IL-6 IL-10 MCF-7 組 20 521.6 ±89.0▲ 3200.21 ±728.09* 213.00 ±61.21▲ 70.43 ±21.89*對照組 20 292.44 ±75.2 2712.45 ±699.78 89.11 ±50.23 92.23 ±30.22

2.4 腫瘤上清誘導的DCs 刺激同種異體T 細胞分泌細胞因子的能力 腫瘤上清誘導的、X 線照射的DCs和純化的CD3+T 以1:20(T/DC)細胞共培養(yǎng)72 小時后，培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量明顯高于對照組，但刺激IL-4 分泌的能力兩組間無明顯差異（圖2）。

圖1 實驗組和對照組的DC 刺激同種異體T 細胞增殖的比較

圖2 腫瘤上清處理的DC 激發(fā)同源異體T 細胞細胞因子的分泌能力

3 討論

DC 在激發(fā)特異性免疫應答中起重要作用。用腫瘤抗原或抗原多肽沖擊致敏DC 和經DC 轉染抑癌基因,均可誘導顯著的抗腫瘤作用。組織活檢發(fā)現,腫瘤組織中有DC 浸潤時,常提示預后良好[2,3,7],然而腫瘤細胞釋放的某些也會抑制DS 的免疫功能，使腫瘤產生免疫逃逸[8,9]。DC 上表面標志的表達與其功能關系密切,DC 對抗原多肽的提呈除需要MHC-II 類分子的參與外,對T 細胞的激活還需要其表面表達的共刺激分子及黏附分子的參與。

本研究中,我們將HER2+MCF-7 細胞的培養(yǎng)上清加入到單核細胞來源的DC 培養(yǎng)體系中,結果發(fā)現，腫瘤上清不僅沒有抑制DC 的表面分子表達和細胞因子分泌，相反還促進了其表達和分泌，這些結果與某些研究著者不一致[10-12],這表明腫瘤對DC 表型和細胞因子表達的影響是腫瘤特異性的。

DC 表面共刺激分子CD80、CD86、CD40 與T 細胞上相應的配體結合，為T 細胞活化提供重要的第二信號。IL-12 是促進Th0 向Th1 分化的重要細胞因子，IL-10 是免疫抑制因子，能抑制MHC 和共刺激分子的表達，阻止Th1 型細胞因子的產生[13]。我們的研究顯示，腫瘤上清增加了DC 表達CD80、CD86、CD40 的水平和分泌TNF-α、IL-6、IL-12 的量，同時降低了IL-10 的分泌量。這表明HER2+乳腺癌細胞可能通過DC 增強T 細胞的功能。我們通過混合淋巴細胞反應發(fā)現，腫瘤上清處理的DC 能刺激T 細胞更強的增殖，同時使其分泌更多的細胞因子包括TNF-α、IL-6、IFN-γ，而IL-4 的分泌卻無明顯增加。IFN-γ是Th1 細胞分泌的主要細胞因子，而IL-4 是Th2 型細胞分泌因子。這些結果表明，HER2+乳腺癌細胞能通過改善DC 的功能，而促進Th1 型細胞免疫應答。當然在體內真實的腫瘤微環(huán)境內，腫瘤細胞對DC 表型和功能的影響還需進一步研究。

盡管多數腫瘤是通過免疫抑制而進行免疫逃逸的，但我們的研究結果表明：HER2+MCF-7 細胞對DC可能產生免疫刺激效應，針對DC 的免疫治療可能是治療Her2+乳腺癌可選擇的一種方法。

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