孫燕 張煦 王登廷 祝杰 鄭吉琦

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)患者在我國以嬰幼兒多見，其中以新生兒的發(fā)病率為最高，據(jù)統(tǒng)計其RB發(fā)病率居眼內(nèi)惡性腫瘤的首位，如果未能及時確診并合理治療，往往產(chǎn)生嚴重的后果，輕者摘除眼球，重者失去生命。依據(jù)我國的人口數(shù)量和新生兒出生率，每年RB新發(fā)病人數(shù)超過1100例，僅次于印度(每年超過1500例)。我國目前的5 a生存率為80%～85%，眼球保存率就更低了?；瘜W(xué)治療結(jié)合多次積極的局部治療(serial aggressive local therapy，SALT)逐步上升為一線治療，而外部放射治療則降為二線治療，眼球摘除為三線治療。它的發(fā)生發(fā)展機制與RB基因密切相關(guān)，但RB基因并非是導(dǎo)致RB發(fā)生的唯一原因。與其他惡性腫瘤一樣，RB的發(fā)生也是多因素共同作用的結(jié)果。

現(xiàn)有研究表明在RB的發(fā)生發(fā)展中，Livin、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)起 到了很重要的作用［1-6］。Livin又名KIAP/ML-IAP，是在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成員，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的細胞凋亡［7］。凋亡抑制蛋白Livin有明顯的抗凋亡作用，在正常人的組織細胞中不表達或很少表達，而在肺癌、胃癌、腎細胞癌、黑色素癌、淋巴瘤、大腸癌和前列腺癌等腫瘤組織中異常高表達。PTEN是Li等［8］于1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，該基因在人類多種腫瘤中存在突變、缺失，是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的又一重要的抑癌基因。MMP-9屬MMP家族中的明膠酶(W型明膠酶)類，大量研究表明，MMP-9在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達，降解、破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質(zhì)，使腫瘤細胞能夠沿著受損的基底膜向周圍組織浸潤，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。

目前關(guān)于 Livin、PTEN及 MMP-9在 RB組織表達情況的研究比較少見，特別對三者相互關(guān)系的研究尚未見報道。我們采用免疫組織化學(xué)法研究PTEN、Livin及MMP-9的表達、共表達，其與RB發(fā)病以及與臨床各型發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討RB可能的發(fā)生機制，并指導(dǎo)判斷RB患者臨床預(yù)后和治療。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇蘭州大學(xué)第二醫(yī)院眼科在2000至2011年進行了眼球摘除術(shù)的RB患兒共56例(RB組)，年齡3個月～7歲，平均3.6歲;其中男29例，女27例。根據(jù)患兒的臨床發(fā)展過程，劃分為眼內(nèi)期(21例)、青光眼期(19例)、眼外期(視神經(jīng)浸潤)(16例)、全身轉(zhuǎn)移期(0例)。同時，另收集正常新鮮視網(wǎng)膜組織10例(正常視網(wǎng)膜組)，選擇病患時注意挑選未經(jīng)放射、化學(xué)藥物及冷凝治療者，以保證研究的準(zhǔn)確性。將所收集標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，預(yù)行HE染色及免疫組織化學(xué)SP染色。主要試劑:即用型兔抗人PTEN單克隆抗體(ZA-0251)、即用型兔抗人MMP-9多克隆抗體(BA0573)、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，即用型兔抗人Livin單克隆抗體(Rs-0738R，上海瑞奇生物科技有限公司)。

1.2 方法 采用SP免疫組織化學(xué)法，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，體積分數(shù)3.3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次。置 0.01 mol·L－1枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗至室溫行抗原修復(fù)，PBS沖洗;正常羊血清工作液封閉，37℃10 min;加入一抗(即用型兔抗人PTEN單克隆抗體、免抗人MMP-9多克隆抗體、免抗人Livin單克隆抗體)，抗體在室溫下孵育2～3 h，經(jīng)PBS沖洗3次，以 PBS(pH 7.4)代替一抗作陰性對照。加入二抗(即用型SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒)，室溫下孵育20 min，PBS沖洗;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min;DAB/H2O2反應(yīng)染色，在終止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 光鏡下觀察，RB切片組織中胞漿和(或)胞膜上出現(xiàn)較多棕黃色顆粒為陽性表達，無棕黃色顆粒出現(xiàn)為陰性表達。PTEN陽性結(jié)果為細胞核及細胞漿呈棕黃色著色，Livin的表達主要位于細胞膜，以出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒作為陽性結(jié)果判定，MMP-9以胞膜或胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色或黃色的顆粒作為陽性判斷結(jié)果。著色強度計分:無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕褐色為3分。每張切片選取10個不同高倍視野(×40)各計數(shù)100個細胞，按陽性細胞所占的百分比計分:≤5%計0分，＞5%～25%計 1分，26%～50%計2分，51%～75% 計3分，＞75% 計4分。取兩項合計，所有RB組及正常視網(wǎng)膜組病例均進行常規(guī)HE染色，然后請兩名病理學(xué)專家對染色結(jié)果進行觀察和復(fù)審的判定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中干預(yù)前后、組間數(shù)據(jù)資料對比采用t檢驗，計數(shù)資料對比采用χ2檢驗，共表達的關(guān)系用相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin、PTEN及 MMP-9的表達 RB組織中Livin陽性表達率高達57.1%(圖1)，而在正常視網(wǎng)膜組織不表達(圖2)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RB中 PTEN蛋白表達陽性率為55.4%(圖3)，正常視網(wǎng)膜10例 PTEN蛋白表達均陽性(圖4)，陽性率為100.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RB組織中MMP-9陽性表達率高達50.0%(圖5)，在正常視網(wǎng)膜組織中不表達(圖6)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 1 Positive expression of Livin in RB(+++;SP，×20)Livin在RB中呈陽性表達(+++;SP，×20)

Figure 2 Negative expression of Livin in normal retinal tissue(SP，×20)Livin在正常視網(wǎng)膜中呈陰性表達(SP，×20)

Figure 3 Positive expression of PTEN in RB(++;SP，×20)PTEN在RB中呈陽性表達(++;SP，×20)

Figure 4 Positive expression of PTEN in normal retinal tissue(++;SP，×20)PTEN在正常視網(wǎng)膜中呈陽性表達(++;SP，×20)

Figure 5 Positive expression of MMP-9 in RB(+;SP，×40)MMP-9在RB中呈陽性表達(+;SP，×40)

Figure 6 Negative expression of MMP-9 in normal retinal tissue(SP，×40)MMP-9在正常視網(wǎng)膜中呈陰性表達(SP，×40)

PTEN、Livin、MMP-9表達與RB臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可見:(1)RB各年齡組中，不論PTEN蛋白表達或Livin、MMP-9蛋白表達在＞3歲兒童和≤3歲兒童間的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P＞0.05)。男女病例組間 PTEN蛋白、Livin蛋白、MMP-9蛋白表達比較，差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05)。(2)在 RB不同臨床分期之間，1－2期RB組織中PTEN、Livin及MMP-9表達陽性率和3－4期陽性率相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P＜0.05)。(3)RB各臨床類型中，PTEN、Livin及MMP-9蛋白表達在31例分化組織、25例未分化組織中表達陽性率與對照組(正常視網(wǎng)膜)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P＜0.05)。(4)PTEN、Livin及MMP-9在有視神經(jīng)浸潤的RB組織中蛋白表達陽性率明顯低于無視神經(jīng)浸潤者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.2 PTEN、Livin及 MMP-9的關(guān)系及共表達PTEN、Livin及MMP-9在RB中的蛋白表達呈一定的相關(guān)性。PTEN與 Livin的表達呈顯著負相關(guān)(r=－0.370，P ＜0.05)，與 MMP-9 的表達也呈顯著負相關(guān)(r=－0.310，P ＜0.05);而 Livin和 MMP-9 在 RB中的表達呈顯著正相關(guān)(r=0.450，P ＜0.01)。性別與 MMP-9、Livin共表達無相關(guān)性(r=－0.130，P ＞0.05);臨床分期與MMP-9、Livin共表達存在正相關(guān)(r=0.434，P ＜0.05)，說明臨床分期越嚴重，MMP-9、Livin越容易共表達;視神經(jīng)受侵犯程度與 MMP-9、Livin共表達存在正相關(guān)(r=0.470，P ＜0.05)，說明視神受經(jīng)侵犯程越嚴重，MMP-9、Livin共表達的可能性較大;組織分化程度與 MMP-9、Livin共表達存在負相關(guān)(r=－0.566，P ＜0.01)，說明組織分化程度越好，MMP-9、Livin越不容易共表達(表2)。本實驗中，PTEN表達與MMP-9、Livin共表達存在負相關(guān)(r=－0.542，P ＜0.01)，說明 PTEN 表達降低時，MMP-9、Livin共表達增加。

表1 PTEN、Livin、MMP-9表達與RB臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 Relationship of PTEN，Livin，MMP-9 expression with clinic pathological parameters of RB

表2 MMP-9、Livin在RB患者性別、臨床分期、視神經(jīng)受侵犯程度、分化程度分類中的共表達Table 2 Co-expression of MMP-9 and Livin in classification with gender，clinical stages，optic nerve infiltration and tissue differentiation

3 討論

目前聯(lián)合研究 PTEN、Livin和 MMP-9在 RB中的表達及相互作用的相關(guān)報道不多。本研究表明Livin、MMP-9在 RB組織中的表達顯著升高，PTEN在RB中的表達顯著降低，說明它們在RB的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

PTEN位于染色體10q23.3，全長200 kb，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子。PTEN蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)，由氨基末端蛋白酪氨酸磷酸醇催化結(jié)構(gòu)域和梭基末端的CZ結(jié)構(gòu)域組成，具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)正常視網(wǎng)膜組10例PTEN蛋白表達均陽性，陽性率為100.0%;而RB中PTEN蛋白表達陽性率為55.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PTEN蛋白表達與年齡、性別無關(guān)，組織分化程度越高其表達越高，但隨臨床分期及視神經(jīng)受浸潤程度增加而顯著降低(P＜0.05)。說明PTEN對RB的發(fā)生有抑制作用，PTEN的缺失或失活在RB的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。張杰等［3］同樣發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白的陽性表達率與臨床分期、病理分型以及是否伴有視神經(jīng)浸潤有關(guān)，而與性別差異無關(guān)。連黎紅等［1］發(fā)現(xiàn) PTEN蛋白陽性表達在正常視網(wǎng)膜組織中較高，隨組織分化程度、腫瘤細胞病理分型、臨床分期的增高，PTEN蛋白陽性表達率明顯下降。因此，PTEN基因表達水平下降可作為RB早期診斷的一個分子標(biāo)記物。

凋亡抑制蛋白Livin又名KIAP/ML-IAP，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的細胞凋亡，屬IAPs家族新成員［7，10］。Livin 基因定位于染色體 20q13，全長 4.6 kb，包含 7 個外顯子及 6 個內(nèi)含子［11］。Livin可以在多種腫瘤細胞中及胎盤、胚胎組織中表達，但在多數(shù)正常成人組織中不表達，可能與腫瘤的形成和細胞增殖活躍密切相關(guān)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)Livin的陽性表達與組織分化程度、臨床分期及視神經(jīng)受浸潤程度顯著相關(guān)，而與年齡、性別無關(guān)，可以作為檢測RB惡性程度和轉(zhuǎn)移能力的一個生物學(xué)指標(biāo)。張萌等［6］發(fā)現(xiàn)腫瘤組 Livin陽性表達率比正常組顯著增加;Livin陽性表達與RB組織病理學(xué)分型相關(guān)，但與臨床分期無關(guān)。

MMP-9高表達與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。MMP-9主要來源于各種腫瘤細胞［13-14］。在正常生理情況下，組織中的MMP-9表達量極少，但是炎性細胞因子、激素以及生長因子等可改變其轉(zhuǎn)錄水平。MMP-9高表達可導(dǎo)致細胞外基質(zhì)和血管基膜降解加速，使腫瘤細胞易于穿過細胞外基質(zhì)和基膜移出癌巢，侵入血管及淋巴管發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移，而且還對腫瘤細胞的黏附能力和能動性有影響［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9的陽性表達在伴有視神經(jīng)浸潤及分化程度低的患者更高，而與年齡、性別無關(guān)。孟利娟［5］同樣發(fā)現(xiàn)RB患者 MMP-9表達顯著增加，未分化型RB組織及有視神經(jīng)浸潤RB組織中的MMP-9表達增加。所以，MMP-9可以作為檢測RB惡性程度和轉(zhuǎn)移能力的一個生物學(xué)指標(biāo)。

本研究表明 PTEN、Livin及 MMP-9基因在 RB中的蛋白表達呈一定的相關(guān)性。PTEN與Livin的表達呈顯著負相關(guān)，與 MMP-9的表達也呈顯著負相關(guān);而Livin和MMP-9在RB中的表達呈顯著正相關(guān)。PTEN表達與MMP-9、Livin共表達存在負相關(guān)，說明PTEN表達降低時，MMP-9、Livin共表達增加，PTEN表達下降伴隨著MMP-9高表達，說明在RB的發(fā)生發(fā)展中這兩種因子可能起協(xié)同作用，而且PTEN對MMP-9的表達有抑制作用。可能的機制為:PTEN可通過蛋白磷酸酶活性調(diào)節(jié)局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)的磷酸化，而 MMP-9為 FAK的下游作用分子，PTEN低表達或缺失時，F(xiàn)AK的磷酸化水平增高，使MMP-9過表達，腫瘤細胞的侵襲能力相應(yīng)增強。另外，PTEN表達下調(diào)可能使細胞間黏附能力降低，MMP-9的表達增加，進而促進腫瘤細胞向基質(zhì)浸潤。但PTEN是否可通過其他未知途徑影響MMP-9的表達，進而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有待進一步研究。而且，PTEN表達與Livin的表達呈負相關(guān)。當(dāng)PTEN在組織中的表達下調(diào)或缺失時，其對PI3K/AKT通路的抑制作用即減弱或消失，可導(dǎo)致AKT磷酸化，引起下游Livin基因的表達上調(diào)，隨即啟動一系列反應(yīng)，從而抑制腫瘤細胞的凋亡［17］。

本研究結(jié)果表明，RB的發(fā)生和發(fā)展是多種因素協(xié)同作用的過程。RB組織中 MMP-9、Livin的激活與PTEN的失活或缺失之間可能存在相互協(xié)同作用，共同參與了RB的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤。聯(lián)合檢測這3種基因蛋白對于評估RB的生物學(xué)行為具有重要價值，有助于估計患者的預(yù)后，為臨床治療提供依據(jù)，可能成為RB新的分子靶向治療位點。

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