杜然然 畢宏生 郭俊國(guó) 王興榮 郭大東 田慶梅

視神經(jīng)病變是臨床常見的眼科疾病，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)是視神經(jīng)病理性損傷的主要靶細(xì)胞。RGC-5的凋亡常見于青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病，因此對(duì)RGC-5的保護(hù)作用成為近年來(lái)視神經(jīng)疾病治療研究的新熱點(diǎn)。枸杞多糖是枸杞的主要有效成分之一，RGC-5是永生化的大鼠RGC細(xì)胞株［1］，屬于未分化幼稚細(xì)胞，近年來(lái)廣泛用于RGC-5相關(guān)研究。本研究利用谷氨酸制作RGC-5凋亡模型，再用不同濃度的枸杞多糖作用于凋亡模型，通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法及AnnexinV-FITC法檢測(cè)枸杞多糖對(duì)RGC-5凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、L-谷氨酸(Sigma)、特級(jí)胎牛血清(Hyclone)、Thy 1.1 單克隆抗體(Abcam)、MTT(Sigma)、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(USA)、PV免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(HF160W，香港力新生物醫(yī)療科技控股有限公司);超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);酶標(biāo)儀(Bio-tek/ELX800，USA);流式細(xì)胞儀(Accuri C6，USA);熒光倒置顯微鏡(O-lympus IX71，Japan);高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Neofuge 15R，香港力新生物醫(yī)療科技控股有限公司)。

1.2 大鼠RGC-5細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 復(fù)蘇RGC-5常規(guī)培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100 U·mL－1鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，隔日換液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3～4 d用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化并按1∶2傳代。采用細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)，常規(guī)培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片，40 g·L－1多聚甲醛固定30 min;置含10 g·L－1Triton的 PBS中，并于37℃孵育20 min;滴加內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑于37℃孵育20 min，PBS洗滌3次;滴加Thy 1.1單克隆抗體(1∶500)，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，于濕盒中4℃過(guò)夜;隔天取出濕盒復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次;滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min;DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色效果，蘇木素復(fù)染。Thy 1.1陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，以胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性染色。

1.3 谷氨酸誘導(dǎo)RGC-5凋亡模型的建立 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加谷氨酸干預(yù))與谷氨酸5個(gè)干預(yù)組(4.0 mmol·L－1、4.5 mmol·L－1、5.0 mmol·L－1、5.5 mmol·L－1、6.0 mmol·L－1)，分別于不同條件下培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。各谷氨酸干預(yù)組細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的69.5% 、60.8% 、49.2% 、45.1% 、42.2% ，5.0 mmol·L－1谷氨酸組存活率約為對(duì)照組的50%，故本研究選用 5.0 mmol·L－1谷氨酸作用 24 h，建立 RGC-5 凋亡模型。

1.4 枸杞多糖對(duì)谷氨酸致RGC-5凋亡模型的影響

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組用5 mmol·L－1谷氨酸培養(yǎng)基作用24 h，枸杞多糖組用5 mmol·L－1谷氨酸培養(yǎng)基作用 24 h 后，繼續(xù)用 10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1枸杞多糖培養(yǎng)基分別作用24 h和48 h。

1.4.2 MTT法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 RGC-5，調(diào)整濃度至每孔10×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，細(xì)胞貼壁后，按照1.4.1中的方法進(jìn)行干預(yù)。枸杞多糖作用24 h及48 h，每孔加 MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后小心吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)，細(xì)胞存活率=各枸杞多糖組A值/對(duì)照組A值。

1.4.3 Annexin V-FITC凋亡檢測(cè) 將RGC-5按每孔0.15×106個(gè)接種于6孔板中，按照1.4.1中的方法進(jìn)行干預(yù);24 h及48 h時(shí)收集貼壁細(xì)胞，用冷PBS洗滌一次;然后將細(xì)胞重懸于 400 μL 1×Binding Buffer中;再加入10 μL Annexin V-FITC 4℃避光孵育15 min;加入5 μL PI于4℃避光孵育5 min。用流式細(xì)胞儀觀察不同濃度枸杞多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，每組收集10×103個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與免疫化學(xué)鑒定 大部分RGC-5細(xì)胞復(fù)蘇24 h后貼壁生長(zhǎng)(圖1)，屬于未分化的幼稚神經(jīng)元，呈上皮樣，有較短的突起，顯微鏡下觀察呈單層生長(zhǎng)。采用Thy 1.1抗體對(duì)RGC-5進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色顆粒狀(圖2)。

Figure 1 Morphology of RGC-5(×200)RGC-5的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2 MTT檢測(cè) 枸杞多糖作用24 h，對(duì)照組存活率為 48.7% ，枸杞多糖組(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)細(xì)胞存活率分別為 53.1%、59.6%、66.9%，對(duì)照組與各濃度枸杞多糖組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P ＜0.05)，40 mg·L－1枸杞多糖組與20 mg·L－1枸杞多糖組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);枸杞多糖作用48 h時(shí)，各濃度枸杞多糖組細(xì)胞存活率分別為 60.5%、75.2%、88.6%，各濃度枸杞多糖組的RGC-5存活率明顯高于對(duì)照組，對(duì)照組與各濃度枸杞多糖組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，且 40 mg·L－1枸杞多糖組 RGC-5 存活率最高，與20 mg·L－1枸杞多糖組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 Annexin V-FITC凋亡檢測(cè) 枸杞多糖作用24 h時(shí)，對(duì)照組凋亡細(xì)胞所占比例為44%，枸杞多糖組(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)凋亡細(xì)胞比例分別為 20.6% 、12.3% 、8.5% ，對(duì)照組與各濃度枸杞多糖組凋亡細(xì)胞所占比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，枸杞多糖作用48 h時(shí)，枸杞多糖組(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)凋亡細(xì)胞比例分別為11.6%、6.2%、3.7%。枸杞多糖作用 24及48 h時(shí)，對(duì)照組與各濃度枸杞多糖組凋亡細(xì)胞所占比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05)，40 mg·L－1枸杞多糖組與 20 mg·L－1枸杞多糖組之間凋亡細(xì)胞所占比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。說(shuō)明枸杞多糖能在一定程度上減少 RGC-5凋亡率，且40 mg·L－1枸杞多糖作用48 h抗凋亡作用最好(圖3)。

Figure 2 Immunohistochemistry staining of Thy 1.1 in RGC-5(×200)RGC-5 Thy 1.1免疫組織化學(xué)染色(×200)

Figure 3 Effects of LBP with different concentration on RGC－5 apoptosis detected by flow cytometry.A:Cultured with 10 mg·L－1 LBP for 24 hours;B:Cultured with 20 mg·L －1 LBP for 24 hours;C:Cultured with 40 mg·L －1 LBP for 24 hours;D:Cultured with 10 mg·L －1 LBP for 48 hours;E:Cultured with 20 mg·L－1 LBP for 48 hours;F:Cultured with 40 mg·L－1 LBP for 48 hours 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度枸杞多糖對(duì)RGC-5細(xì)胞凋亡的影響。A:10 mg·L－1枸杞多糖作用24 h組;B:20 mg·L－1枸杞多糖作用24 h組;C:40 mg·L－1枸杞多糖作用24 h組;D:10 mg·L－1枸杞多糖作用48 h組;E:20 mg·L－1枸杞多糖作用48 h組;F:40 mg·L－1枸杞多糖作用48 h組

3 討論

枸杞是一種傳統(tǒng)的中藥，有“滋補(bǔ)肝腎，益精明目，平衡陰陽(yáng)”等效用［2］。枸杞多糖是枸杞生物學(xué)作用的主要有效成分之一，是枸杞子萃取酒精的過(guò)程中去除脂溶性物質(zhì)(如玉米黃質(zhì)素和其他類胡蘿卜素)而得到的含有多種微量元素和氨基酸的蛋白雜多糖［3］。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖具有多種藥理作用和生物活性，在抗凋亡、抗氧化［4］、加強(qiáng)免疫作用［5］、降低血糖［6］、延緩衰老［7］、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝臟［8］、降低化療與放療的副作用［9］和減輕胰島素抵抗［10］中能發(fā)揮重要作用。

RGC-5的進(jìn)行性死亡是青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)炎、視神經(jīng)萎縮、慢性缺血性視神經(jīng)病變以及視網(wǎng)膜色素變性等許多視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病發(fā)展的必經(jīng)之路。谷氨酸是正常存在于視網(wǎng)膜中的一種神經(jīng)遞質(zhì)，但是當(dāng)向活體玻璃體內(nèi)注射谷氨酸或者用谷氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的RGC進(jìn)行干預(yù)時(shí)，有可能因量過(guò)多引起興奮性毒性作用，導(dǎo)致 RGC的凋亡。

Thy1.1作為一種經(jīng)典的 RGC-5特異性標(biāo)記物，目前已被廣泛用于RGC-5的標(biāo)記鑒定與分離純化。

我們對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行Thy1.1免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成了棕黃色顆粒狀，從而證明本課題中使用的細(xì)胞為RGC-5細(xì)胞系。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)的RGC-5在被谷氨酸作用后發(fā)生了凋亡，5 mmol·L－1谷氨酸作用24 h可造成約50%的RGC-5凋亡，并且不同濃度的枸杞多糖對(duì)發(fā)生凋亡的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞存活率在一定程度上有了提高，并且濃度為40 mg·L－1的枸杞多糖作用48 h后細(xì)胞存活率最高，呈現(xiàn)劑量-時(shí)間依賴性。Annexin V-FITC檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的枸杞多糖對(duì)發(fā)生凋亡的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率一定程度上有下降，并且濃度為40 mg·L－1的枸杞多糖作用48 h后細(xì)胞凋亡率最低，呈現(xiàn)劑量-時(shí)間依賴性。Mi等［11］研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠通過(guò)下調(diào)內(nèi)皮素-1、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物及其受體、β-淀粉樣蛋白的表達(dá)來(lái)減輕青光眼模型中的視神經(jīng)損傷;Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中，枸杞多糖通過(guò)下調(diào)水通道蛋白、保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障和減少氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用。本課題組將繼續(xù)深入研究枸杞多糖對(duì)RGC-5的保護(hù)機(jī)制。

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