梁婷 范明 馬蘭茗 隋曉紅

脈絡(luò)膜上腔跨視網(wǎng)膜電刺激是近年來提出的一種新型的視網(wǎng)膜視覺假體，相比之前的兩種視網(wǎng)膜視覺假體(視網(wǎng)膜上視覺假體和視網(wǎng)膜下視覺假體)來講，該假體具有很多優(yōu)勢(shì)，如:避免了電極與視網(wǎng)膜直接接觸帶來的損傷，電極容易在體內(nèi)長(zhǎng)期固定等等。在過去的幾年中，該領(lǐng)域內(nèi)的研究證明了這種新興假體的可行性［1-4］，有關(guān)假體的刺激參數(shù)的研究還相對(duì)較少［5］。由于刺激參數(shù)直接決定了假體的安全性和有效性，因此我們對(duì)實(shí)際應(yīng)用中所涉及的各種刺激參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究(脈沖寬度、刺激頻率以及脈沖波形)，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面可以用來指導(dǎo)假體刺激器的設(shè)計(jì)，另一方面可以輔助實(shí)際應(yīng)用中選擇安全有效的電刺激方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年白兔15只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg(上海交通大學(xué)激光與光子醫(yī)學(xué)生物研究所提供)。所有操作過程符合眼及視力研究協(xié)會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)定。

1.2 刺激電極 實(shí)驗(yàn)采用的薄膜電極(圖1)由中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所提供，刺激點(diǎn)的材料為鉑金。

1.3 手術(shù)過程 白兔耳緣靜脈注射30 g·L－1異戊巴比妥鈉1 mL·kg－1誘導(dǎo)動(dòng)物麻醉，將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)上。每0.5 h靜脈給予30 g·L－1異戊巴比妥鈉0.3 mL維持麻醉狀態(tài)。美多麗散瞳劑(復(fù)方托吡卡胺滴眼液)滴眼，散大雙眼瞳孔。手術(shù)顯微鏡下開瞼器撐開眼瞼，環(huán)形剪開下方球結(jié)膜，分離并剪斷下直肌。角鞏膜緣后10 mm與角鞏膜緣平行切開鞏膜3 mm，暴露脈絡(luò)膜。將薄膜電極輕柔地順著鞏膜切口植入脈絡(luò)膜上腔，刺激點(diǎn)部位到達(dá)眼球后極部，視盤正下方。5-0線將薄膜電極固定于鞏膜上。常規(guī)眼底檢查，確定電極植入位置，檢查是否有脈絡(luò)膜脫離及出血等并發(fā)癥。

Figure 1 Photograph of electrode array.The 3 ×4 electrode array consisted of platinum monopolar planar electrodes of 50 μm，150 μm，350 μm，and 500 μm diameter mounted on a 30 μm thick polyimide strip 聚酰亞胺薄膜電極。薄膜電極帶有3×4的12電極陣列，包含有直徑50 μm、150 μm、350 μm、500 μm 的四種尺寸的刺激點(diǎn)

1.4 皮層信號(hào)的記錄 切開頭部皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨。根據(jù)白兔視網(wǎng)膜與視皮層的投射對(duì)應(yīng)關(guān)系，于植入眼的對(duì)側(cè)視皮層相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)(距垂直中線約 4 mm、Bregma點(diǎn)后 11 mm，大小約 5.00 mm×5.00 mm)記錄電刺激誘發(fā)的響應(yīng)。該區(qū)域內(nèi)鉆3×3(9)個(gè)孔，將不銹鋼螺釘擰入孔中，末端與硬腦膜接觸，作為記錄電極。在植入眼同側(cè)的視皮層相應(yīng)位置(Bregma點(diǎn)前6 mm、中線旁4 mm處)，鉆入不銹鋼螺釘作為參考電極。不銹鋼針插入兔耳皮下作為地電極。采用多通道電生理記錄系統(tǒng)(System 3，Tucker-Davis Technologies，Alachua，F(xiàn)L，USA)，帶通頻率為3～500 Hz，記錄到的結(jié)果為50個(gè)皮層反應(yīng)疊加后的平均結(jié)果。

1.5 刺激閾值的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中采用電荷平衡的雙相脈沖進(jìn)行電刺激，脈沖寬度分別為0.25 ms、0.50 ms、0.75 ms、1.00 ms、刺激頻率為 1 Hz、2 Hz、4 Hz。首先給以閾下刺激，逐步增加刺激強(qiáng)度，直到一個(gè)穩(wěn)定、確切的皮層響應(yīng)電誘發(fā)電位(electrical evoked potential，EEP)出現(xiàn)，我們將這個(gè)最小的電流強(qiáng)度確定為閾電流。閾電流乘以脈沖脈寬，則得到閾電荷。將閾電荷除以刺激電極的面積，則得到相應(yīng)的閾電荷密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 同一動(dòng)物體內(nèi)獲得的結(jié)果，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較;不同的動(dòng)物體內(nèi)獲得的結(jié)果采用方差分析進(jìn)行比較(ANOVA)。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中采用直徑為50 μm的刺激點(diǎn)進(jìn)行電刺激，刺激頻率為1 Hz，脈沖寬度分別為 0.25 ms和1.00 ms時(shí)，誘發(fā)EEP所需的閾電荷密度分別為1.0 mC·cm－2和 2.1 mC·cm－2，電極表面發(fā)生了明顯的腐蝕，其他尺寸的電極未發(fā)生損壞。

2.1 皮層的響應(yīng) 皮層記錄到的EEP波形和視覺誘發(fā)的反應(yīng)(visual voked potential，VEP)的波形相類似，但潛伏期存在著顯著的差異。VEP的潛伏期為(24.7±2.2)ms(n=5)，EEP 的潛伏期為(13.1±1.9)ms(n=5)，明顯短于VEP的潛伏期(P＜0.05;圖2)。

2.2 刺激頻率對(duì)于EEP幅度的影響 刺激強(qiáng)度不變，隨著刺激頻率的增加，EEP的幅度逐漸下降。我們將1 Hz時(shí)EEP的幅度作為1，其他頻率下獲得的EEP的幅度與其相比求得相對(duì)的幅度。結(jié)果顯示:1 Hz時(shí)EEP幅度為 1.00±0.00;2 Hz時(shí)幅度降低到為0.61±0.03;4 Hz時(shí)幅度為 0.36±0.07;當(dāng)刺激頻率達(dá)到6 Hz時(shí)，EEP幅度降低為1 Hz時(shí)的12%，為0.12±0.06。并且隨著刺激頻率的增加，EEP的潛伏期也隨之延長(zhǎng)。從1 Hz時(shí)的(14.4±2.8)ms增加到6 Hz的(17.72±1.1)ms。當(dāng)刺激頻率增加到8 Hz時(shí)，沒有記錄到EEP。

Figure 2 Waveform of VEP(a)and EEP(b)recorded at visual cortex.VEP:The flash power of the photic stimulator was 90 mJ with frequency of 1 Hz;EEP:Stimulus current was a biphasic current pulse with anodic-or cathodic-first stimulation at the pulse durations(stimulus amplitude was 200 μA，pulse duration was 0.5 ms and stimulus frequency was 1 Hz) 在兔的視皮層記錄到的VEP(a)和EEP(b)的波形。VEP:刺激的能量為90 mJ，頻率為1 Hz;EEP:刺激波形為先負(fù)后正的電荷平衡的雙相脈沖，幅度200 μA、脈沖寬度0.5 ms，刺激頻率 1 Hz

2.3 不同的刺激頻率下電極尺寸對(duì)閾電流強(qiáng)度的影響 無論在哪一刺激頻率下，500 μm電極和350 μm電極誘發(fā)皮層響應(yīng)所需的閾電流大小之間無明顯差異(P＞0.05，圖3)。在低頻脈沖刺激下(1 Hz)小電極(150 μm)誘發(fā)EEP所需的電流強(qiáng)度比大電極(350 μm、500 μm)低(P＜0.05，圖 3);隨著刺激頻率的增加，誘發(fā)EEP所需的閾電流強(qiáng)度也隨之增加，當(dāng)刺激頻率為2 Hz時(shí)，三種尺寸的電極之間的閾電流無明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)刺激頻率增加為4 Hz時(shí)，盡管三者所需的閾電流之間差異依然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但此時(shí)150 μm電極所需的閾電流要略高于大電極(500 μm、350 μm)所需的閾電流(圖3)。

Figure 3 Effects of electrode size on threshold current 電極尺寸對(duì)閾電流強(qiáng)度的影響

2.4 電極尺寸、脈沖寬度和刺激頻率共同對(duì)于閾電流的影響 整體上誘發(fā)皮層響應(yīng)所需的閾電流均隨著脈沖寬度的增加而減小，隨著刺激頻率的增加而增加(圖3)。無論采用哪種尺寸的電極進(jìn)行刺激，在4 Hz下獲得的閾電流的大小總是高于1 Hz時(shí)所需的閾電流(P＜0.05)，這種增加的比率在短脈沖寬度(0.25 ms)刺激時(shí)為77%(500 μm 電極)和170%(150 μm 電極);在長(zhǎng)脈沖寬度(1.0 ms)刺激時(shí)，增加的比率較低，約為38%(500 μm電極)和131%(150 μm 電極)。

2.5 刺激波形對(duì)于閾電流的影響 采用先負(fù)后正及先正后負(fù)兩種刺激脈沖進(jìn)行電刺激，先負(fù)后正的刺激脈沖誘發(fā)EEP所需的閾電流總是低于先正后負(fù)的刺激脈沖所需的閾電流(P＜0.05，圖4)。

Figure 4 Effects of stimulus waveforms on threshold current(*statistical differences).Pulse duration was 0.25 ms and stimulus frequency was 1 Hz 刺激波形對(duì)于閾電流的影響(*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。脈沖跨度為0.25 ms，刺激頻率為1 Hz

3 討論

3.1 與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較 本實(shí)驗(yàn)誘發(fā)EEP所需的閾值與其他研究小組獲得的結(jié)果相接近［4］。Sakaguchi等［3］使用直徑 100 μm 的電極、0.5 ms 的脈沖寬度在脈絡(luò)膜上腔對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行電刺激時(shí)，所需的閾電流大小為66 μA。而我們研究中采用的直徑150 μm電極、0.5 ms的脈沖寬度進(jìn)行刺激時(shí)，閾電流大小為50.8 μA，兩者非常接近。對(duì)于電極尺寸與閾電流之間的關(guān)系，我們獲得的結(jié)果并未如期待的那樣:大電極需要的閾值高，小電極需要的閾值低。研究發(fā)現(xiàn)500 μm和350 μm電極誘發(fā) EEP所需的閾電流強(qiáng)度沒有明顯的差異，這可能是電極與視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間的距離導(dǎo)致的。有研究表明在視網(wǎng)膜表面進(jìn)行電刺激時(shí)，大電極誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮所需的閾值高，小電極所需的閾值低。隨著電極不斷的遠(yuǎn)離視網(wǎng)膜表面，大電極與小電極之間的差異消失［6］。同時(shí)在 Chowdhury 等［7］和 de Balthasar等［8］的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，當(dāng)電極距離視網(wǎng)膜一定位置時(shí)，電極尺寸與閾電流的大小無關(guān)。在我們的研究中，電極植入的位置位于脈絡(luò)膜上腔，電極與視網(wǎng)膜之間也存在著一定的距離，可能是這一距離消除了500 μm電極和350 μm電極之間的差異。

3.2 電極尺寸的選擇 實(shí)驗(yàn)中采用直徑為50 μm的電極進(jìn)行刺激時(shí)，誘發(fā)EEP相應(yīng)的閾電荷密度，顯然高于鉑電極所能承受的最大電荷密度0.35 mC·cm－2，因此電極發(fā)生了損壞［9-10］。這可能與電極過小有關(guān)，由于過小的電極誘發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)的數(shù)量較少，為了獲得一個(gè)可觀察到的皮層反應(yīng)，勢(shì)必需要增大刺激強(qiáng)度。此外，由于電極植入的位置相對(duì)于視網(wǎng)膜上和視網(wǎng)膜下電極來說，距離視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元位置相對(duì)較遠(yuǎn)，加之視網(wǎng)膜色素上皮層附加的阻抗較高［11］，因此誘發(fā) EEP 所需的刺激閾值較高［12］。由此可見對(duì)于STS視覺假體來說，使用過小尺寸的電極是不安全的。目前人們正在使用各種電化學(xué)技術(shù)對(duì)電極的表面進(jìn)行加工修飾，使其光滑的表面變得粗糙，增加電極實(shí)際的使用面積，從而降低電荷密度，達(dá)到避免電極和組織損傷的目的［13-15］。

3.3 刺激參數(shù)最優(yōu)組合 研究中發(fā)現(xiàn)，高頻刺激時(shí)小電極(150 μm)比大電極(500 μm)需要更大的刺激強(qiáng)度，并且當(dāng)刺激頻率達(dá)到一定高度時(shí)，加大刺激強(qiáng)度也未能引出皮層的響應(yīng)，這可能是由于反復(fù)地電刺激導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性下降的結(jié)果，尤其是小電極更為明顯。與此同時(shí)，大電極伴隨長(zhǎng)脈沖寬度刺激時(shí)，刺激強(qiáng)度隨著刺激頻率增加的幅度最小，此時(shí)也可能對(duì)神經(jīng)元興奮性的影響最小。因此大電極伴以長(zhǎng)脈沖寬度可能是未來STS視覺假體實(shí)際應(yīng)用中優(yōu)先選擇的刺激方案。此外由于先負(fù)后正的刺激脈沖所需的閾電流較低，因此這也將成為未來優(yōu)先選擇的刺激波形。

本實(shí)驗(yàn)采用脈絡(luò)膜上腔跨視網(wǎng)膜電刺激的方式，對(duì)電刺激中各種參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，盡管研究結(jié)果揭示了刺激參數(shù)的優(yōu)化的組合方式，但是具體參數(shù)的選擇將會(huì)產(chǎn)生怎樣的視覺感覺依然不十分清楚，這就需要我們進(jìn)一步了解這種電刺激潛在的神經(jīng)機(jī)制，因?yàn)橹挥姓嬲卣J(rèn)識(shí)這種人工裝置才能更好地為盲人提供完美的視覺。

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