李林 徐劍容 王詠針 孫玉瑩 李斌

人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，hRPE)細(xì)胞是人類視網(wǎng)膜內(nèi)的重要細(xì)胞，在維持光感受器細(xì)胞正常的代謝和功能中起關(guān)鍵作用。但在一些病理?xiàng)l件下，hRPE細(xì)胞異常增生是導(dǎo)致人類眼部疾病的主要原因，如增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、脈絡(luò)膜新生血管、息肉樣脈絡(luò)膜血管病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等。國內(nèi)外許多研究已經(jīng)證實(shí)多種生長因子，如血小板生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝素結(jié)合生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)等，均在 PDR、PVR 等眼部增生性疾病的形成中起重要作用［1］，這些作用主要是通過刺激hRPE細(xì)胞增生、黏附和遷移來實(shí)現(xiàn)的。在這些反應(yīng)過程中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)1/2信號(hào)通路處于高度激活狀態(tài)，阻斷ERK1/2信號(hào)通路可以抑制hRPE細(xì)胞的增生和遷移。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)與hRPE細(xì)胞上的 EGF受體(EGFR)結(jié)合就可以激活ERK1/2信號(hào)通路，引起細(xì)胞增生和遷移，參與眼病的發(fā)生。以往的針對(duì)其他種類的體細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，微小 RNA-7(miRNA-7)對(duì) ERK1/2的激活有抑制作用。所以，我們不禁聯(lián)想miRNA-7對(duì)hRPE可能有相似作用從而抑制PVR的形成。本文在以往工作的基礎(chǔ)上，擬通過研究 miRNA-7對(duì)體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞 EGFR表達(dá)、ERK1/2信號(hào)通路、增生、遷移和凋亡的影響，深入研究 miRNA-7在PVR等疾病形成中所起到的作用，并盡可能考察其在臨床治療中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 hRPE細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 hRPE細(xì)胞取自健康成年角膜移植的供體眼，于死亡12 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。在無菌狀態(tài)下，棄除眼前段及玻璃體，自視盤處分離并去除視網(wǎng)膜神經(jīng)層，形成眼杯。D-hank液沖洗眼杯2次。12.5 g·L－1胰蛋白酶(美國 Sigma公司)37℃下消化45 min。吸除消化液，加入含體積分?jǐn)?shù)20%小牛血清(美國 Gibco公司)、青霉素(100 U·L－1)及鏈霉素(100 U·L－1)的改良 Eagle培養(yǎng)液(DMEM，美國Gibco公司)。經(jīng)反復(fù)輕輕吹打及沖洗后，將沖洗液移入離心管中，1 000 r·min－1離心10 min，共2次。hRPE細(xì)胞以50×103個(gè)·mL－1的密度接種于含體積分?jǐn)?shù) 20%小牛血清DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、濕度為90%的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d更換1次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合傳代。

選第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞爬片，采用鏈霉親合素生物素化過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法(武漢博士德公司試劑盒)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，一抗為鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(pan-ck，Santa Cruz公司)。

1.2 miRNA-7合成及轉(zhuǎn)染

1.2.1 合成 根據(jù)miRNA-7序列，由廣州銳博生物科技有限公司合成miRNA-7和陰性microRNA前體(產(chǎn)品號(hào)分別為PM10047、AM17110)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 轉(zhuǎn)染效率 采用購自廣州銳博的綠色熒光蛋白(GFP)熒光標(biāo)記的miRNA-7前體，用無菌去離子水將 miRNA-7前體稀釋為20 mmol·L－1。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)。將常規(guī)條件下培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞離心，去上清，用不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為3 ×106個(gè)·mL－1，接種于 6 孔板，每孔 1.5 mL。轉(zhuǎn)染過程如下:全程避光，將稀釋過的miRNA-7前體溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 分別與 250 μL OPTIM-MEM 1混勻?yàn)?A液，將 5 μL脂質(zhì)體與 250 μL OPTIMMEM 1混勻?yàn)锽液，室溫下靜置5 min;將A液與B液混合，室溫下靜置20 min;將混合液輕輕加入孔中，混勻;常規(guī)條件培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，熒光顯微鏡下觀察，攝影。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 將常規(guī)條件下培養(yǎng)的hRPE去上清，用不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)·mL－1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板(蛋白和RNA檢測采用6孔板，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用96孔板，其他實(shí)驗(yàn)采用24孔板)，根據(jù)前期轉(zhuǎn)染優(yōu)化結(jié)果，每孔加入miRNA-7前體和轉(zhuǎn)染試劑，使 miRNA-7前體的終濃度為 50 nmol·mL－1，脂質(zhì)體的終濃度為 2.5 μg·mL－1。轉(zhuǎn)染 48 h 后，進(jìn)行下一步檢測。實(shí)驗(yàn)分為4組:miRNA-145干預(yù)組即miRNA-7前體干預(yù)組、陰性 miRNA對(duì)照組、空脂質(zhì)體組、空白對(duì)照組。

1.2.2.3 Real-Time PCR 檢測成熟 miRNA-7 的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用Trizol RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，－20℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒(美國Fermentas公司)說明進(jìn)行，miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物(cat.4366596)，miRNA-7PCR引物 (cat.4373145)，內(nèi) 參 U6 PCR 引 物 (cat.4373381)均由廣州銳博生物科技有限公司合成。使用美國ABI公司 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，按照試劑說明書配制20 μL反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，2 × POWER SYBRGreen PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各4 μL，無核酸水1 μL。加入八連管后，上ABI 7500型熒光定量PCR儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測，反應(yīng)條件如下:50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 30 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán);在 60 ℃收集熒光信號(hào);循環(huán)結(jié)束后65～95℃繪制溶解曲線。每個(gè)樣本檢測均重復(fù)3次，相對(duì)定量采用比較Ct法:U6 作為內(nèi)參照，ΔCt=CtmiRNA-7－CtU6，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對(duì)照組，根據(jù)公式可以計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組中miRNA-7基因表達(dá)情況，即實(shí)驗(yàn)組miRNA-7基因表達(dá)倍數(shù)(Fold)=2－ΔΔCt。

1.3 細(xì)胞增殖和遷移

1.3.1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖抑制 轉(zhuǎn)染后48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL(中國碧云天生物科技研究所)，常規(guī)條件下孵育 60 min，酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tek公司)檢測450 nm波長處每孔的吸光度值(A值)，按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(cells inhibitor，CI)，即 CI=1－(處理組平均 A值/空白組平均 A值)×100%。

1.3.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用直徑為8.5 mm的Boyden小室進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的檢測。實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2.2，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別取4組細(xì)胞，用 DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌后將密度調(diào)整為106個(gè)·mL－1，在趨化小室的下層加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，然后蓋上8 μm的微孔多聚碳酸酯濾膜。在趨化小室的上層分別加入已經(jīng)制備好的800 μL細(xì)胞懸液，于常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 h。此后拆卸裝置，用棉簽擦去多聚碳酸酯濾膜上層的細(xì)胞，然后用甲醛固定，蘇木精染色，在400倍光學(xué)顯微鏡下每張膜隨機(jī)觀察5個(gè)視野并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每組遷移細(xì)胞數(shù)為15個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間miRNA-7轉(zhuǎn)染率采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料之間比較采用 χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 消化下來的hRPE細(xì)胞呈圓形，大小相似，富含黑色素顆粒，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。接種入培養(yǎng)瓶中2－4 d后，細(xì)胞貼壁變扁平，呈多邊形;細(xì)胞伸出偽足，呈集落樣生長。14－28 d細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底，致密排列，呈六邊形或多邊形。隨著傳代的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的黑色素顆粒逐漸減少，到第4代后，細(xì)胞內(nèi)的色素顆粒基本消失，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形，向成纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?？菇堑鞍兹旧?，細(xì)胞胞漿呈棕黃色，可見典型的角蛋白中間絲網(wǎng)架。

2.2 miRNA-7合成及轉(zhuǎn)染

2.2.1 化學(xué)合成miRNA-7前體可以成功轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞 采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，以GFP為熒光標(biāo)記物，轉(zhuǎn)染后24 h觀察，轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞的胞膜和胞漿中可見綠色熒光。當(dāng)miRNA-7前體的終濃度為 50 nmol·mL－1、脂質(zhì)體的終濃度為 2.5 μg·mL－1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到80%以上(圖1)。

Figure 1 Chemical synthesis precursor microRNA-7 can be transfected into hRPE cells successfully，staining with green fluorescent(200) 化學(xué)合成的miRNA-7前體可以成功轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞，顯示綠色熒光(×200)

2.2.2 miRNA-7前體轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞后成熟 miRNA-7的表達(dá)情況 miRNA-7前體干預(yù)組每高倍視野下成熟 miRNA-7數(shù)為(56.06±3.45)個(gè)，與空白對(duì)照組的(1.00±0.03)個(gè)、空脂質(zhì)體組的(0.96±0.02)個(gè)和陰性 miRNA 對(duì)照組的(1.02±0.04)個(gè)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);空脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P ＞0.05)。

2.3 miRNA-7對(duì)hRPE細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組、空脂質(zhì)體組及陰性 miRNA對(duì)照組比較，miRNA-7對(duì)hRPE細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。miRNA-7前體干預(yù)組細(xì)胞增殖抑制率(23.58%)明顯高于陰性 miRNA對(duì)照組(2.35%)、空脂質(zhì)體組(2.97%)與空白對(duì)照組(0%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，空脂質(zhì)體組、陰性 miRNA對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P ＞0.05)。

2.4 miRNA-7對(duì)hRPE細(xì)胞遷移的影響 miRNA-7可抑制 hRPE細(xì)胞的遷移。細(xì)胞誘導(dǎo)5 h后，在miRNA-7前體干預(yù)組中，遷移細(xì)胞數(shù)明顯較少，每高倍視野為(16.0±3.8)個(gè);而在陰性 miRNA對(duì)照組、空脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組中，遷移細(xì)胞數(shù)明顯較多，每高倍視野分別為(32.2±7.8)個(gè)、(31.4±6.9)個(gè)和(33.9±8.4)個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，miRNA-7前體干預(yù)組遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于陰性miRNA對(duì)照組、空脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);而陰性miRNA對(duì)照組、空脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05;圖2-圖 3)。

Figure 2 In blank control cell migration images，more visible migration cells could be seen(×200) 空白對(duì)照組細(xì)胞遷移圖，可見遷移細(xì)胞較多(×200)

Figure 3 In migration images of microRNA-7 precursor cell intervention groups，less visible migration cells could be seen(× 200)miRNA-7前體干預(yù)組細(xì)胞遷移圖，可見遷移細(xì)胞較少(×200)

3 討論

hRPE細(xì)胞是人眼視網(wǎng)膜內(nèi)的重要細(xì)胞，在維持光感受器細(xì)胞正常代謝和功能中起關(guān)鍵作用，其最特異的功能在于它對(duì)感光細(xì)胞外節(jié)的吞噬作用。吞噬作用是視色素降解和再生循環(huán)周期中的一個(gè)環(huán)節(jié)。hRPE的吞噬作用有賴于細(xì)胞內(nèi)的溶酶體系統(tǒng)。hRPE細(xì)胞無再生能力，不出現(xiàn)有絲分裂。細(xì)胞死亡后由鄰近的細(xì)胞向側(cè)面運(yùn)動(dòng)，移行衍生死亡細(xì)胞遺留下來的空間。hRPE的各項(xiàng)生理功能是否正常，受到來自脈絡(luò)膜與視網(wǎng)膜的共同影響。隨著年齡增長，視網(wǎng)膜中黑色素逐漸減少，而脂褐質(zhì)逐漸增多。這種脂褐質(zhì)的增加開始只發(fā)生在hRPE的基底膜側(cè)，隨年齡增加逐漸擴(kuò)展至全部細(xì)胞質(zhì)，而使hRPE細(xì)胞的代謝受影響。PVR的增生膜主要由色素上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞構(gòu)成［2］。hRPE細(xì)胞在PVR等增生性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，它不僅是增生膜形成和收縮的主要細(xì)胞，而且可以產(chǎn)生趨化因子，吸引纖維膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞參與增生膜的形成。

EGF屬于ErbB受體家族，在人體內(nèi)多種組織中都有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)增生、分化和發(fā)育［3-5］。PVR患者的玻璃體、視網(wǎng)膜下液以及增生膜中都有多種生長因子的存在和表達(dá)。張惠蓉等［6］用放射免疫法測定了PVR患者玻璃體中EGF的濃度，發(fā)現(xiàn)有顯著升高，與血清中EGF無關(guān)，且PVR增生膜中 EGFR高表達(dá)。hRPE細(xì)胞的增生與生長因子及其受體的相互作用有關(guān)，相關(guān)研究證實(shí)EGF與EGFR特異性結(jié)合可刺激hRPE細(xì)胞的增生、移行，在PVR形成過程中起重要作用［7］。

miRNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性、非編碼、長19～25個(gè)堿基的莖環(huán)形核苷酸轉(zhuǎn)錄物［8］，通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)堿基完全或不完全配對(duì)結(jié)合，引起mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡。目前為止，有大約678種人類的miRNA序列被確認(rèn)［9］，后續(xù)會(huì)有越來越多的人類miRNA被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種不同的生理過程中均起關(guān)鍵作用，包括發(fā)育調(diào)控、造血細(xì)胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生和器官發(fā)育等，與腫瘤、病毒感染、代謝性疾病的發(fā)病也有關(guān)。

人視網(wǎng)膜中有多種miRNA分子的表達(dá)。對(duì)視網(wǎng)膜的320種基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)其中存在有67種miRNA分子的可能作用靶點(diǎn)［10］，miRNA-7就是其中的一種。miRNA-7由22個(gè)堿基組成，序列為5’-UUGUUUUAGUGAUCAAGAAGGU-3’。實(shí)驗(yàn)表明，EGFR mRNA的3’端非翻譯區(qū)有3個(gè)miRNA-7的作用靶點(diǎn)，miRNA-7通過與之結(jié)合，抑制多種信號(hào)通路的激活，包括 ERK1/2，影響細(xì)胞的分化、增生和凋亡，從而參與病理生理過程。體外研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7通過與EGFR mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制ERK1/2和Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增生［11］。另外的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［12］。在果蠅體內(nèi)，在EGFR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子Yan降解的同時(shí)，miRNA-7高表達(dá)，并且通過與Yan的非翻譯區(qū)結(jié)合抑制它的翻譯，進(jìn)一步降低Yan的水平，誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞的分化［13］。

在本研究中我們采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，以GFP為熒光標(biāo)記物，轉(zhuǎn)染24 h后觀察，轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞的胞膜和胞漿中可見綠色熒光。當(dāng)miRNA-7前體的終濃度為50 nmol·mL－1、脂質(zhì)體的終濃度為2.5 μg·mL－1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到 80% 以上;與空白對(duì)照組、空脂質(zhì)體組及陰性 miRNA對(duì)照組比較，miRNA-7前體干預(yù)組中成熟 miRNA-7的表達(dá)較其他3組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，空脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05)。另外，與空白對(duì)照組、空脂質(zhì)體組及陰性 miRNA對(duì)照組比較，miRNA-7對(duì) hRPE細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。miRNA-7組細(xì)胞增殖抑制率(23.58%)明顯高于陰性 miRNA 對(duì)照組(2.35%)、空脂質(zhì)體組(2.97%)與空白對(duì)照組(0%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，空脂質(zhì)體組、陰性 miRNA對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。miRNA-7抑制hRPE細(xì)胞的遷移，細(xì)胞誘導(dǎo)5 h后，在miRNA-7前體干預(yù)組中，遷移細(xì)胞數(shù)明顯較少，每高倍視野為(16.0±3.8)個(gè)，與其他3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);在陰性 miRNA對(duì)照組、空脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組中，遷移細(xì)胞數(shù)明顯較多，每高倍視野分別為(32.2±7.8)個(gè)、(31.4±6.9)個(gè)和(33.9±8.4)個(gè)，3組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。以往的研究已經(jīng)證明絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，普遍存在于多種生物中。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由高度保守的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)傳遞信號(hào)，通過蘇氨酸和酪氨酸雙位點(diǎn)磷酸化激活 MAPK［14］。根據(jù)序列的同源性和功能，MAPK家族分為4類，即 ERK1/2、c-Jun N端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)、p38及ERK5/BMK1［15］。激活的MAPK通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等，參與細(xì)胞增生、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。ERK1/2信號(hào)通路(Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2)是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能被生長因子、血清及佛波酯等外界刺激激活。研究資料表明［16］，EGF可通過與細(xì)胞膜上的特異性酪氨酸激酶受體(EGFR)結(jié)合，激活ERK1/2信號(hào)通路，磷酸化與脯氨酸相鄰的絲/蘇氨酸，具有廣泛的催化活性，介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究結(jié)果證實(shí)，miRNA-7可明顯抑制 hRPE細(xì)胞的增殖和遷移，由于miRNA-7中不存在與 MMP-2和 MMP-9的 3’-UTR區(qū)基因互補(bǔ)序列，我們猜測這種抑制作用可能是由于miRNA-7對(duì)hRPE細(xì)胞的EGFR通路產(chǎn)生了良好的靶向沉默后效應(yīng)，直接下調(diào)EGFR表達(dá)，從而阻斷或部分阻斷了ERK1/2信號(hào)通路，使得hRPE細(xì)胞的增殖和遷移受到明顯抑制。

由于miRNA種類較多，與其他各種細(xì)胞因子作用廣泛且交叉，加上其表達(dá)的組織特異性、時(shí)間差異性，我們對(duì)其真正的作用機(jī)制尚無深入了解，本實(shí)驗(yàn)只是初步證實(shí)miRNA-7可明顯抑制hRPE細(xì)胞的增殖和遷移，為下一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下良好的理論基礎(chǔ)。miRNA-7的研究尚處于起步階段，其參與PVR等眼部增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展的其他機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 張承芬，董方田，陳有信，趙明威.眼底病學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:284-286.

2 李林，李斌，楊安懷，趙婷秀，邢怡橋.人視網(wǎng)膜下膜中ICAM-1及MMP-2的免疫組織化學(xué)研究［J］.眼科新進(jìn)展，2005，25(5):519-521.

3 Yano S，Kondo K，Yamaguchi M，Richmond G，Hutchison M，Wakeling A，et al.Distribution and function of EGFR in human tissue and the effect of EGFR tyrosine kinase inhibition［J］.Anticancer Res，2003，23(5):3639-3650.

4 李曉梅，劉建紅，呂欣，李曉鶯，劉向紅.胃腸功能障礙早產(chǎn)兒胃液表皮生長因子水平變化及意義［J］.中華實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27(6):424-426.

5 鄭翠俠，韓兵，周翔，張榮新，萬歡英，臧旺福.非小細(xì)胞肺癌中表皮生長因子受體基因突變的篩查［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28(2):190-192.

6 張蕙蓉，曹景泰.視網(wǎng)膜增生性疾病玻璃體中表皮生長因子的放射受體定量測定［J］.中華眼底病雜志，1996，12(2):91-93.

7 Lewis TS，Shapiro PS，Ahn NG.Signal transduction through MAP kinase cascades［J］.Adv Cancer Res，1998，74(1):49-139.

8 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281-297.

9 Griffiths-Jones S，Grocock RJ，van Dongen S，Bateman A，Enright A.miRBase:microRNA sequences，targets and gene nomenclature［J］.Nucleic Acids Res，2006，34(1):140-144.

10 Arora A，McKay GJ，Simpson DA.Prediction and verification of miRNA expression in human and rat retinas［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(9):3962-3967.

11 Bravo-Egana V，Rosero S，Molano RD，Pileggi A，Ricordi C，Domínguez-Bendala J.et al.Quantitative differential expression analysis reveals miR-7 as major islet microRNA［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366(4):922-926.

12 Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，F(xiàn)ord LP.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(4):1290-1297.

13 Li X，Carthew RW.A microRNA mediates EGF receptor signaling and promotes photoreceptor differentiation in the Drosophila eye ［J］.Cell，2005，123(7):1267-1277.

14 Chang L，Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades［J］.Nature，2001，410(6824):37-40.

15 Rincon M .MAP-Kinase signaling pathways in T cells［J］.Curr Opin Immunol，2001，13(3):339-345.

16 Kolch W.Meaningful relationships:the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions［J］.Biochemistry，2000，351(2):289-305.