李雪 王海燕 郝永娜 趙少貞 劉文廣 李亞楠 邊領(lǐng)齋 粘紅 魏瑞華

角膜病變和角膜損傷是僅次于白內(nèi)障的第二位致盲眼病，可以通過(guò)角膜移植治愈。人工角膜的出現(xiàn)，使角膜移植擺脫了供體缺乏和移植成功率低的問(wèn)題，但目前應(yīng)用的人工角膜術(shù)后有一定比例的并發(fā)癥，如繼發(fā)性青光眼、植入物排出、角膜滲漏、眼內(nèi)炎、角膜溶解及視網(wǎng)膜脫離等［1-3］，嚴(yán)重時(shí)會(huì)直接導(dǎo)致視力喪失［4］，限制了其臨床應(yīng)用。同時(shí)嚴(yán)重新生血管化的角膜植床因免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植失敗率高達(dá)20%～30%，甚至60%以上［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究一種能夠抑制角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)生長(zhǎng)的角膜替代物，通過(guò)同種異體角膜植片對(duì)比來(lái)評(píng)價(jià)此種替代物作為角膜支架材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 角膜支架材料由天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供。材料1為膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠角膜替代物材料(Coll-Glyco SIPN，膠原基復(fù)合角膜替代物);材料2為負(fù)載可遞送內(nèi)皮抑制素基因的膠原基復(fù)合角膜替代物(專利號(hào):CN 201210435892)。

角膜支架材料的性能:直徑 12.00 mm，厚度300.00 μm，曲率半徑7.25 mm。白光透光率90%以上，平衡含水量90%以上，力學(xué)性能(0.60±0.10)mPa，體外膠原酶(12 μg·mL－1)降解實(shí)驗(yàn)，30 h 內(nèi)剩余質(zhì)量在40%以上。正常兔角膜平衡含水量為(75.6±1.3)%，透光率為(89±1)%，遮光指數(shù)1.357，拉伸強(qiáng)度(2.77±1.77)mPa［6-7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用健康成年大耳白兔105只，雌雄不限，體質(zhì)量 2.0～2.5 kg，由天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組30只(每只兔左眼為實(shí)驗(yàn)眼，右眼不施手術(shù)為正常對(duì)照眼)，Ⅰ組、Ⅱ組分別行板層植入材料1、2;Ⅲ組為同種異體對(duì)照組，行同種異體角膜板層移植。各組根據(jù)不同處死時(shí)間隨機(jī)分為3 d、7 d、15 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月6個(gè)亞組，每個(gè)亞組各5只。其余15只兔(30眼)作為Ⅲ組角膜移植供體來(lái)源。

1.3 方法 整個(gè)手術(shù)操作過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作步驟。在兔角膜中心區(qū)域剖切植床，直徑6.00 mm，約2/3角膜厚度。Ⅰ組、Ⅱ組處理:6.25 mm環(huán)鉆取支架材料作為供體，用10-0縫線采用上覆縫合方法［8］將植片固定于植床上，術(shù)后用左氧氟沙星眼液滴眼，每天4次，氧氟沙星眼膏每天1次，持續(xù)2周。Ⅲ組處理:用6.25 mm環(huán)鉆鉆取供體兔角膜前板層2/3角膜厚度，隧道刀剖切獲得同種異體角膜板層移植片，10-0縫線間斷縫合，術(shù)后用藥同Ⅰ組、Ⅱ組。

1.4 角膜大體情況觀察 術(shù)后3 d、7 d、15 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行肉眼及裂隙燈觀察各組的角膜情況，包括角膜透明度及CNV情況。角膜透明度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］:完全透明(0分);輕度混濁，虹膜紋理可見(jiàn)(1分);中度混濁，虹膜紋理模糊(2分);重度混濁，瞳孔可見(jiàn)(3分);極重度混濁，前房看不見(jiàn)(4分)。CNV評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］:角膜無(wú)明顯 CNV(0分);植床周圍有CNV(1分);CNV達(dá)植片周邊部(2分);CNV達(dá)植片中周部(3分);CNV布滿角膜植片(4分)。

1.5 組織學(xué)觀察 分別于術(shù)后3 d、7 d、15 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月處死動(dòng)物，行HE染色，光鏡下觀察角膜病理切片;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白K3(BD，美國(guó))和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白(R＆D，美國(guó))在角膜組織的表達(dá)。兔眼球石蠟切片經(jīng)脫蠟至水，用標(biāo)準(zhǔn)SP兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。滴加一抗于4℃條件下孵育過(guò)夜，然后與二抗于37℃條件下孵育30 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染后封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 采用 SPSS 19.0軟件，分別對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的角膜透明度評(píng)分與CNV評(píng)分進(jìn)行Friedman秩和檢驗(yàn)，兩組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較進(jìn)行Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈觀察結(jié)果 術(shù)后3 d，三組均可見(jiàn)角結(jié)膜充血水腫，Ⅰ組(圖1A1)、Ⅱ組隱見(jiàn)瞳孔，結(jié)膜囊內(nèi)有分泌物;Ⅲ組瞳孔可見(jiàn)(圖1A2)。術(shù)后7 d，角膜水腫減輕，Ⅰ組仍呈現(xiàn)彌漫樣水腫，角膜緣上方有細(xì)小 CNV向植片生長(zhǎng);Ⅱ組、Ⅲ組瞳孔清晰可見(jiàn)，角膜緣上方有細(xì)小 CNV向植片生長(zhǎng)(圖1B1、B2)。術(shù)后15 d，Ⅰ組、Ⅱ組(圖1C1)結(jié)膜充血基本消失，角膜緣CNV向植片生長(zhǎng);Ⅲ組結(jié)膜充血消失，角膜水腫局限在縫線周圍，圍繞縫線周圍有小部分混濁區(qū)域，CNV密度明顯增高，集中在上方(圖1C2)。術(shù)后1個(gè)月，角膜基本透明，Ⅰ組、Ⅱ組可見(jiàn)CNV呈短毛刷狀從角膜緣向植片方向生長(zhǎng)，主要集中在上方(圖1D1);Ⅲ組部分CNV變細(xì)、退化(圖1D2)。術(shù)后3個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組角膜圍繞縫線處仍殘留小部分混濁，部分 CNV變細(xì)、退化;Ⅲ組角膜圍繞縫線處仍殘留小部分混濁，可見(jiàn)CNV大部分減退。至術(shù)后6個(gè)月，各組角膜殘留局部混濁區(qū)域，未見(jiàn)明顯CNV(圖2)。整個(gè)觀察期間，未見(jiàn)角膜植床壞死、潰瘍。

Figure 1 Corneal growth observed by slit lamp after corneal transplantation.A1，A2:3 days in groupⅠ and group Ⅲ;B1，B2:7 days in groupⅡ and groupⅢ;C1，C2:15 days in groupⅡand groupⅢ;D1，D2:1 month in groupⅡ and groupⅢ 角膜移植術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察情況。A1、A2:術(shù)后3 d，Ⅰ組、Ⅲ組角膜生長(zhǎng)情況;B1、B2:術(shù)后7 d，Ⅱ組、Ⅲ組角膜生長(zhǎng)情況;C1、C2:術(shù)后15 d，Ⅱ組、Ⅲ組角膜生長(zhǎng)情況;D1、D2:術(shù)后1個(gè)月，Ⅱ組、Ⅲ組角膜生長(zhǎng)情況

Figure 2 No obvious CNV was seen in each group at postoperative 6 months.A:GroupⅠ;B:GroupⅡ;C:GroupⅢ 術(shù)后6個(gè)月，各組角膜未見(jiàn)明顯CNV。A:Ⅰ組;B:Ⅱ組;C:Ⅲ組

2.2 角膜透明度及新生血管評(píng)分 隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)角膜透明度評(píng)分逐漸升高(Ⅰ組:χ2=55.614，P=0.000;Ⅱ組:χ2=22.360，P=0.000;Ⅲ 組:χ2=16.376，P=0.006)。術(shù)后 3 d、7 d、3 個(gè)月，Ⅰ組和Ⅲ組角膜透明度評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05，見(jiàn)表1)。術(shù)后7 dⅠ組和Ⅱ組角膜透明度評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表2);其余時(shí)間點(diǎn)各組間角膜透明度評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。

術(shù)后3 d、7 d、15 d，各組 CNV評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，至術(shù)后15 d達(dá)最高，后逐漸降低(Ⅰ組:χ2=56.789，P=0.001;Ⅱ組:χ2=20.652，P=0.001;Ⅲ組:χ2=21.541，P=0.000)。術(shù)后 3 d、7 d、15 d，Ⅰ組和Ⅲ組 CNV評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05，見(jiàn)表1);術(shù)后7 d，Ⅰ組和 Ⅱ 組CNV評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表2);其余時(shí)間點(diǎn)各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P ＞0.05)。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果 術(shù)后3 d，Ⅰ組、Ⅱ組角膜中央上皮大部分缺損，周邊上皮向中央生長(zhǎng)，均勻紅染的膠原物質(zhì)覆蓋表面，基質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞在植片與切口交界處明顯(圖3A1);Ⅲ組角膜上皮局部缺損，淺基質(zhì)水腫明顯，成纖維細(xì)胞略有增加(圖3A2)。術(shù)后7 d，Ⅰ組、Ⅱ組角膜表面單層上皮細(xì)胞局部覆蓋，基質(zhì)層內(nèi)可見(jiàn)逐漸降解的膠原物質(zhì);Ⅲ組成纖維細(xì)胞數(shù)量增加較明顯。術(shù)后15 d，Ⅰ組淺基質(zhì)有較多的成纖維細(xì)胞，沉積的膠原纖維排列仍不規(guī)則(圖3B1);Ⅱ組成纖維細(xì)胞較少，膠原纖維排列不規(guī)則;Ⅲ組上皮完整，基質(zhì)膠原纖維排列基本規(guī)則，成纖維細(xì)胞數(shù)量有所減少(圖3B2)。術(shù)后1個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組角膜上皮均覆蓋完全，淺基質(zhì)層膠原纖維排列趨于規(guī)則，但仍較正常基質(zhì)紊亂(圖3C1);Ⅲ組膠原纖維排列趨于一致，局部欠規(guī)則(圖3C2)。術(shù)后3個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組上皮修復(fù)良好，膠原纖維排列局部欠均勻;Ⅲ組膠原纖維排列局部欠規(guī)則。至術(shù)后6個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組膠原纖維排列規(guī)則，部分區(qū)域存在小的膠原紊亂區(qū)(圖3D1、D2);Ⅲ組細(xì)胞層次清楚，基質(zhì)膠原排列規(guī)則(圖3D3)。

表1 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Ⅰ組、Ⅲ組角膜透明度及新生血管評(píng)分Table 1 Scores of corneal transparency and CNV in groupⅠand groupⅢ at each postoperative time point(Score)

表2 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Ⅰ組、Ⅱ組角膜透明度及新生血管評(píng)分Table 2 Scores of corneal transparency and CNV in groupⅠand group II at each postoperative time point(Score)

Figure 3 HE staining of corneal tissue after corneal transplantation(×400).A1，B1:3 days in groupⅠ and group Ⅲ;B1，B3:15 days in groupⅠand groupⅢ;C1，C2:1 month in groupⅠand groupⅢ;D1，D2，D3:6 months in groupⅠ，groupⅡ and groupⅢ 角膜移植術(shù)后角膜組織 HE染色(×400)。A1、A2:術(shù)后 3 d，Ⅰ組、Ⅲ組角膜組織;B1、B2:術(shù)后 15 d，Ⅰ組、Ⅲ組角膜組織;C1、C2:術(shù)后 1 個(gè)月，Ⅰ組、Ⅲ組角膜組織;D1、D2、D3:術(shù)后6個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組角膜組織

2.4 免疫組織化學(xué)檢查

2.4.1 K3檢測(cè) 術(shù)后6個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白K3檢測(cè)均為陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。

2.4.2 VEGF檢測(cè) 術(shù)后 15 d，三組在切口處和1/3淺基質(zhì)處炎性細(xì)胞胞漿VEGF表達(dá)呈陽(yáng)性，附近炎性細(xì)胞明顯，Ⅰ組、Ⅱ組可見(jiàn)少量CNV(圖5)。術(shù)后6個(gè)月，三組1/3淺基質(zhì)處炎性細(xì)胞均明顯減少，VEGF染色陽(yáng)性，Ⅲ組與Ⅰ組、Ⅱ組比較VEGF表達(dá)減少(圖5)。

3 討論

Figure 4 Expression of K3 at 6 months after corneal transplantation(DAB，×400).A:GroupⅠ;B:GroupⅡ;C:GroupⅢ 角膜移植術(shù)后6個(gè)月，角膜組織K3表達(dá)(DAB，×400)。A:Ⅰ組;B:Ⅱ組;C:Ⅲ組

Figure 5 Expression of VEGF in corneal matrix after corneal transplantation(DAB，×400).A1，A2，A3:15 days in group Ⅰ，group Ⅱ and groupⅢ;B1，B2，B3:6 months in groupⅠ，groupⅡ and groupⅢ 角膜移植術(shù)后角膜組織角膜組織VEGF表達(dá)(DAB，×400)。A1、A2、A3:術(shù)后15 d，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組兔角膜基質(zhì)VEGF表達(dá);B1、B2、B3:術(shù)后6個(gè)月，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組兔角膜基質(zhì)VEGF表達(dá)

隨著近年來(lái)組織工程技術(shù)的發(fā)展，羊膜、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、纖維蛋白、膠原等生物組織常被應(yīng)用于人工角膜的研究。膠原以其免疫原性低、易獲得、無(wú)化學(xué)材料降解產(chǎn)生酸性降解產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到科研工作者的重視，但膠原的力學(xué)強(qiáng)度差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)交聯(lián)劑EDC和NHC對(duì)去端肽豬皮Ⅰ型膠原進(jìn)行交聯(lián)后，并通過(guò)特殊的上覆縫合法進(jìn)行固定從而避免其缺點(diǎn)［10］，結(jié)果表明，該材料與白兔剩余角膜基質(zhì)床貼附良好。

本實(shí)驗(yàn)中，隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，三組角膜透明度評(píng)分逐漸升高，術(shù)后3 d、7 d、3個(gè)月，Ⅰ組、Ⅲ組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05);術(shù)后7 d，Ⅰ組和Ⅱ組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分析原因可能與手術(shù)的機(jī)械性刺激有關(guān)，但主要還是與角膜受到機(jī)械性損傷后自身修復(fù)過(guò)程有關(guān)。早期炎性細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞聚集到損傷區(qū)域，隨后炎性細(xì)胞、角膜細(xì)胞合成或激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)，并釋放到淚膜中，在整個(gè)病理過(guò)程中發(fā)揮主要作用。角膜基質(zhì)對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)主要依賴于角膜細(xì)胞的作用，創(chuàng)傷附近健康的角膜細(xì)胞增殖、移行至創(chuàng)傷區(qū)，并分化為成纖維細(xì)胞，合成并分泌膠原、硫酸軟骨素、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)。開(kāi)始時(shí)基質(zhì)是混濁的，主要是由于新合成的ECM結(jié)構(gòu)高度紊亂，本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果也證明新合成的角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。隨著時(shí)間的推移，在活化 MMP，尤其是成纖維細(xì)胞分泌的MMP作用下，膠原重塑，混濁逐漸消退。但是，MMP濃度過(guò)高易導(dǎo)致角膜潰瘍穿孔，過(guò)低就會(huì)引起角膜瘢痕化［11-12］。

三組CNV評(píng)分在術(shù)后3 d、7 d、15 d隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，至術(shù)后15 d達(dá)最高，后逐漸降低。羊膜、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)等天然角膜支架材料的主要成分膠原可能會(huì)造成一部分抗原成分的殘留，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的是去端肽豬皮Ⅰ型膠原，作為一種異體材料，雖然已將其末端含有免疫原位點(diǎn)的非螺旋部分去掉，降低了其免疫原性，但不排除部分存在，實(shí)驗(yàn)組新生血管相對(duì)密集并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)可能與此相關(guān)［13］。Burns等［14］提出:在新生血管形成因子中 VEGF起著核心作用，角膜損傷后傷口處堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表達(dá)增強(qiáng)［15-16］，bFGF作為角膜組織的正常生理成分，在正常角膜組織全層中都有分布，正常狀態(tài)下主要以無(wú)活性或低活性形態(tài)存在于細(xì)胞間質(zhì)中，體外實(shí)驗(yàn)表明，0.1～1.0 ng·mL－1bFGF 可明顯地刺激 FGF、內(nèi)皮細(xì)胞等增殖，同時(shí)其又是一種趨化因子，對(duì)晶狀體纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、FGF和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有趨化作用［15，17］，三組 CNV 評(píng)分均逐漸增高，達(dá)高峰后逐漸下降。步建平等［18］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠穿透性角膜移植術(shù)后bFGF表達(dá)持續(xù)升高至傷后3周，隨后表達(dá)水平開(kāi)始下降，而新生血管的表達(dá)與bFGF呈正相關(guān)，CNV的消退與創(chuàng)傷修復(fù)后bFGF水平下降以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)異體抗原產(chǎn)生的免疫耐受相關(guān)［19］。另外，因材料的力學(xué)強(qiáng)度未完全達(dá)到活體角膜的要求，采用上覆縫合法對(duì)角膜的愈合、CNV的發(fā)生和發(fā)展也存在一定的影響。隨著1個(gè)月后手術(shù)縫線的拆除及炎癥反應(yīng)的降低，新生血管逐漸變細(xì)并且退化，提示膠原基復(fù)合角膜替代材料具有較好的生物相容性。

本研究中組織病理檢查結(jié)果顯示:Ⅰ組、Ⅱ組由術(shù)后3 d起，角膜中央上皮層大部分缺損，基質(zhì)層水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸修復(fù)，淺層基質(zhì)膠原纖維排列紊亂;至術(shù)后1個(gè)月角膜上皮覆蓋完全，淺基質(zhì)層膠原纖維排列趨于規(guī)則;雖然在術(shù)后6個(gè)月部分區(qū)域存在小的膠原紊亂區(qū)，但與Ⅲ組相比未見(jiàn)明顯異常。并且Ⅰ組、Ⅱ組術(shù)后6個(gè)月角膜上皮細(xì)胞K3免疫組織化學(xué)染色均為陽(yáng)性，說(shuō)明角膜上皮細(xì)胞增生修復(fù)，上皮重建，表明膠原材料可介導(dǎo)細(xì)胞黏附、增殖。但Ⅰ組、Ⅱ組的VEGF染色結(jié)果未見(jiàn)明顯差異，表明材料2對(duì)新生血管的抑制效應(yīng)不明顯，可能由于內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)的釋放與體外有差異。

膠原基復(fù)合角膜替代材料是一種擁有良好光學(xué)性能與一定力學(xué)強(qiáng)度的角膜移植材料，并且在兔角膜組織內(nèi)能支持角膜上皮的生長(zhǎng)，促進(jìn)活性角膜基質(zhì)的改建，但距離活體角膜的力學(xué)強(qiáng)度還有較大差距，其負(fù)載的內(nèi)皮抑制素的體內(nèi)釋放對(duì)新生血管的抑制作用還不明顯。下一步我們將繼續(xù)提高角膜材料體內(nèi)移植的穩(wěn)定性，加強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度，降低材料的免疫性，改進(jìn)內(nèi)皮抑制素的負(fù)載方式和體內(nèi)釋放。膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)角膜替代物具有較好的體內(nèi)外生物相容性，進(jìn)一步改進(jìn)后有望成為一種新型的角膜移植支架材料。

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