司艷芳 樊旭 關(guān)娟 周歷 趙娟

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是裂孔源性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗常見的原因［1］。在 PVR膜的細胞成分中最重要的細胞之一是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞。研究發(fā)現(xiàn)，RPE細胞的增生與PVR發(fā)病機制相關(guān)［2-5］。非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白 B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白［6］，廣泛表達于多種組織［7］。研究表明GPNMB與多種疾病的生理、病理過程相關(guān)［8］。但尚未有文獻報道GPNMB對RPE細胞生物學(xué)功能的影響。因此，本研究采用免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗、MTT等方法，檢測GPNMB在不同病變程度PVR中的定量表達以及GPNMB對RPE細胞增殖、細胞周期的影響，擬在探討GPNMB在PVR病變中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集解放軍309醫(yī)院在2012年1月至12月確診的18例PVR患者的視網(wǎng)膜表面增生膜?；颊吣挲g15～60歲。PVR病變程度分級標(biāo)準(zhǔn)參照1991年美國視網(wǎng)膜學(xué)會的分級方法，分為A、B、C 3級。

1.2 主要儀器及試劑 CO2細胞培養(yǎng)箱(Binder公司，德國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Sheldon公司，美國)，流式細胞儀(Olympus，日本)，激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad公司，美國)。限制性內(nèi)切酶 EcoRI、XhoI，T4連接酶，RNA 酶，胰蛋白酶(Takara，大連)，LipofectamineTMRNAiMAX，載體 pMD19-T、pcDNA3.1(+)(Invitrogen，美國)，抗 GPNMB抗體、抗生物素標(biāo)記的Texas Red、FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Abcam，美國)，M254 培養(yǎng)基、G418、MTT、碘化吡啶(GIBCO BRL，美國)。

1.3 引物及 siRNA GPNMB-P1:5’-AACCTTGAGTGCCTGCGTC-3’，GPNMB-P2:5’-ACTT-CCCCAAACCACAATATCTA-3’;GPNMB-P3:5’-CCGGAATTCATGGAATGTCTCTACTATTTCCTGGGAT-3’，含 EcoRI酶切位點;GPNMB-P4:5’-CCGCTCGAGTCATTAAGAAACTCCTTTAAATTCTTG-3’，含 XhoI酶切位點。靶向 GPNMB的 siRNA序列:GPNMB(sense:5’-GGGCAAUGAAAGACCUUCUTT-3’，antisense:5’-AGAAGGUCUUUCAUUGCCCTT-3’)。所有引物均由上海生工合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫熒光 石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟，進行如下操作:滴加正常羊血清(1∶50稀釋)，室溫溫育 30 min;漂洗后與抗 GPNMB(1∶50稀釋)一抗于4℃孵育過夜;漂洗后與生物素標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)在37℃溫育30 min;最后滴加抗生物素標(biāo)記的Texas Red(1∶1000稀釋)，于37℃放置30 min。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后用甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并進行定量分析。同時設(shè)有PBS替代一抗的空白對照。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 于患者玻璃體切割術(shù)前抽取3 mL靜脈血，離心取血清－20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清中GPNMB的含量。以我院檢驗科健康成年查體者作對照，抽血離心取血清－20℃保存。

1.4.3 人RPE細胞的分離及培養(yǎng) 摘取尸眼球，將眼球放入含200 mg·L－1慶大霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液中，自角膜緣后5 mm環(huán)形剪開眼球壁，棄眼球前段，在解剖顯微鏡下切除、吸凈玻璃體，用 DHank液清洗眼杯2次，加入215 kU·L－1透明質(zhì)酸酶和1.25 g·L－1胰蛋白酶混合液，置于37℃孵箱中消化3 min，棄酶混合液，仔細分離神經(jīng)上皮層，于視盤周圍將其剪除，繼以2.5 g·L－1胰蛋白酶加入眼杯中，置于37℃孵箱中消化70 min，取出眼杯，用吸管輕輕吹打使細胞脫落，收集RPE細胞懸液;6000 r·min－1離心15 min，棄上清液，將細胞懸浮于培養(yǎng)液中，然后接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.4 真核表達載體的構(gòu)建 以實驗室保存的GPNMB序列為模板，以 GPNMB-P1、GPNMB-P2引物擴增 GPNMB目的片段，與 pMD19-T載體在16℃條件下進行連接反應(yīng)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，培養(yǎng)后進行篩選，挑選陽性菌落搖菌并提取質(zhì)粒，電泳鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMD19T-GPNMB。以重組質(zhì)粒為模板，以 GPNMBP3、GPNMB-P4為引物，擴增 GPNMB編碼區(qū)序列，擴增產(chǎn)物以EcoRI、XhoI雙酶切，并用T4 DNA連接酶將其與經(jīng)相同酶切的真核表達載體 pcDNA3.1(+)連接，篩選獲得重組表達載體 pcDNA3.1(+)-GPNMB。

1.4.5 轉(zhuǎn)染 按每孔50×103個 RPE細胞接種至24孔培養(yǎng)板中，待其長至50%融合時按脂質(zhì)體L2000的操作說明進行轉(zhuǎn)染。具體方法:加入100 μL無血清 M254培養(yǎng)基(內(nèi)含 siRNA 6 pmol，Lipofectamine 1 μL)，混勻后于體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，24 h后經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定表達GPNMB的RPE細胞。

1.4.6 細胞增殖實驗 將 RPE細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。將實驗分為對照組、GPNMB轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化各組 RPE 細胞，吸去胰蛋白酶，加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 min。每孔加入 MTT 溶液(5 g·L－1)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后進行比色測定，酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下讀取OD值。

1.4.7 細胞周期實驗 PBS洗滌RPE細胞1次，加FITC-Annexin-V(fluroscein isothiocyanate-Annexin-V)，室溫避光放置20 min，PBS洗滌2次，加500 μL甲醛，冰浴25 min，PBS洗滌2次，加入含有10 mg·L－1碘化吡啶和1 g·L－1RNA酶的 PBS緩沖液，室溫避光孵育20 min，待流式細胞儀檢測?？瞻讓φ战M采用培養(yǎng)基假誘導(dǎo)［9］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPNMB在PVR增生膜中的表達 運用計算機分析系統(tǒng)對PVR增生膜中GPNMB的熒光量作定量分析。結(jié)果如圖1所示，A級 PVR的增生膜中GPNMB陽性熒光總量為5.07，而 B級膜中 GPNMB熒光總量為 11.21，C級膜中 GPNMB熒光總量為19.34。該結(jié)果表明了PVR病變程度越高，GPNMB的熒光強度越強，因此，我們推斷GPNMB與PVR疾病有著密切的關(guān)系。

Figure 1 Expression of GPNMB in PRM of PVR(*P ＜0.05，＊＊P＜0.01)GPNMB在 PVR 增生膜中的表達(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)

2.2 GPNMB在PVR患者血清中的表達 為了進一步驗證免疫熒光實驗的結(jié)果，我們采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測了PVR患者血清中的 GPNMB含量。結(jié)果如圖2所示，與正常人血清中GPNMB的含量相比，PVR患者血清中GPNMB的含量有顯著上升，該結(jié)果表明GPNMB可以作為PVR患者血清的生物標(biāo)志物用于PVR疾病的診斷。

Figure 2 Expression of GPNMB in the serums of patients with PVR GPNMB在PVR患者血清中的表達水平

2.3 GPNMB對RPE細胞增殖的影響 RPE細胞是PVR病理過程的關(guān)鍵因素之一，因此我們研究了GPNMB對RPE細胞的作用，這對進一步研究PVR的發(fā)病機制有著重要意義。通過MTT法測定各組反應(yīng)細胞數(shù)的OD值，結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，空載體轉(zhuǎn)染組基本無變化，GPNMB轉(zhuǎn)染組則可以顯著促進RPE細胞的增殖，其OD值是對照組的3.7倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);然后以 GPNMB過表達的人RPE細胞為研究對象，加入GPNMB-siRNA觀察它對 RPE細胞增殖的影響，結(jié)果表明GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染組可以顯著抑制RPE細胞的增殖(P＜0.05)。該結(jié)果說明了 GPNMB在 RPE細胞增殖過程中起著重要作用。

Figure 3 Effects of GPNMB on proliferation of RPE cells.A:Overexpression-GPNMB could significantly promote the proliferation of RPE cells;B:GPNMB-specific siRNA could obviously inhibit the proliferation of RPE cells treated with overexpression-GPNMB GPNMB對RPE細胞增殖的影響。A:GPNMB過表達可以顯著促進RPE細胞的增殖;B:特異性的GPNMB-siRNA可以顯著抑制GPNMB過表達處理的RPE細胞的增殖

2.4 GPNMB對RPE細胞周期的影響 細胞周期與細胞增殖有著密切的聯(lián)系，因此我們推斷GPNMB可能通過調(diào)控RPE細胞周期來促進其增殖。GPNMB處理無血清培養(yǎng)的RPE細胞24 h后，流式細胞儀檢測GPNMB轉(zhuǎn)染對細胞周期的影響。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，GPNMB過表達及 siRNA對細胞周期均有顯著影響，因此，GPNMB通過細胞周期調(diào)控途徑促進RPE細胞的增殖。

3 討論

Figure 4 Effects of GPNMB on RPE cells cycle.A:Image of RPE cells cycle;B:GPNMB-siRNA could decrease the percentage of S phase of RPE cells cycle;C:GPNMB-overexpression could increase the percentage of S phase of RPE cells cycle GPNMB對RPE細胞周期的影響。A:RPE細胞周期圖;B:GPNMB-siRNA可降低RPE細胞周期S期細胞的百分比;C:GPNMB過表達可增加RPE細胞周期S期細胞的百分比

PVR是一種以細胞增生及牽拉性視網(wǎng)膜脫離為特征的眼部疾患;是孔源性視網(wǎng)膜脫離和眼外傷最嚴重的并發(fā)癥，常常引起失明和眼球萎縮。它的基本病理過程是眼內(nèi)細胞，包括 RPE細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和成纖維細胞樣細胞等移行進入玻璃體內(nèi);黏附在玻璃體視網(wǎng)膜界面上，增生產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，在玻璃體內(nèi)及視網(wǎng)膜表面形成有收縮能力的膜;膜收縮牽拉視網(wǎng)膜脫離，視力喪失［10］。GPNMB作為一種糖基化的跨膜蛋白，參與了多種細胞的生理功能。最近研究表明GPNMB在多種細胞的增生過程中起到重要作用［11-13］，因此，本文研究了 GPNMB與 PVR的關(guān)系以及GPNMB對RPE細胞的作用。

免疫熒光結(jié)果顯示，PVR增生膜的病變程度越高，GPNMB的熒光強度越強，該結(jié)果表明了GPNMB與PVR疾病的發(fā)展過程可能有著密切的聯(lián)系。為了驗證GPNMB與PVR疾病有關(guān)系，我們采用酶聯(lián)免疫吸附試驗比較了正常人與PVR患者血清中GPNMB的含量，結(jié)果表明PVR患者血清中GPNMB的含量遠高于對照組，由此我們推測GPNMB可以作為PVR患者血清的生物標(biāo)志，用于PVR疾病的診斷。PVR的發(fā)病機制主要是與RPE細胞的病理性增生相關(guān)，結(jié)合GPNMB在RPE細胞中有表達，我們推測GPNMB對RPE細胞的增生可能起著一定的作用。本實驗我們構(gòu)建了GPNMB的siRNA以及過表達載體，采用轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入RPE細胞，然后采用MTT法檢測GPNMB對RPE細胞增殖的影響。結(jié)果表明GPNMB-siRNA可以顯著抑制RPE細胞的增殖，而GPNMB過表達則會顯著促進其增殖，由此我們推測GPNMB可能是RPE細胞的一個調(diào)控分子，影響著它的增生，進而導(dǎo)致PVR的發(fā)展。流式細胞儀測定RPE細胞周期結(jié)果顯示，GPNMB轉(zhuǎn)染組的S期細胞比例與無血清培養(yǎng)的對照組相比有明顯的增加，而GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染組則顯著減少，進一步印證了MTT的實驗結(jié)果。

綜上所述，GPNMB作為PVR中的一個關(guān)鍵分子，通過細胞周期調(diào)控途徑影響RPE細胞的增殖，但其具體作用機制還有待于進一步研究，這為PVR的預(yù)防及治療提供了有益的思路。

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