高小燕 何守志

核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是1986年首先從B細(xì)胞核中提取到，近年在腫瘤中研究較熱的一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子及免疫基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)。一般情況下，NF-κB 與其抑制蛋白 IκB(inhibitory кB，IκB)結(jié)合呈非活性狀態(tài)，但受刺激后可以和IκB解離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞因子、黏附分子、生長因子和急性蛋白等因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在疾病的調(diào)節(jié)，尤其是炎癥性疾病的啟動(dòng)中起重要作用［1］。近年來研究的焦點(diǎn)在于NF-κB在新生血管形成中的作用［2-3］。本實(shí)驗(yàn)僅就NF-κB在脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)中的表達(dá)作一研究。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與主要藥品試劑 氪激光機(jī)(美國Coherent公司，型號為Novua 2000);FFA攝像機(jī)(德國Heideberg公司);Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。小鼠抗大鼠NF-κB單克隆抗體0.1 mL、AEC顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)多克隆抗體、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)原位雜交檢測試劑盒、即用型SABC 試劑盒、0.01 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液、SP-9002免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BN大鼠CNV模型的建立 48只健康雄性棕色BN大鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，系清潔級動(dòng)物，體質(zhì)量200～220 g，隨機(jī)選取一眼作為實(shí)驗(yàn)眼。0.5 g·L－1復(fù)方托品酰胺滴眼液滴雙眼散瞳，左下腹腔內(nèi)注射100 g·L－1水合氯醛溶液(3.0 mL·kg－1)麻醉，檢查雙眼前節(jié)和眼底均正常。依照趙世紅等［4］的方法建立CNV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)眼前放置－53 D的接觸鏡，氪激光(647 nm)距視盤等距離圍繞視盤視網(wǎng)膜光凝20點(diǎn)。激光參數(shù):功率360 mW，光斑直徑 100 μm，曝光時(shí)間 0.05 s。

1.2.2 FFA檢查 分別于視網(wǎng)膜光凝后 1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周，各選取 6只大鼠進(jìn)行全身麻醉、散瞳，腹腔內(nèi)注射100 g·L－1熒光素鈉0.3 mL，行FFA檢查。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取6張F(tuán)FA圖像，進(jìn)行積分光密度(integrated optical density，IOD)值計(jì)算，取其平均值。

1.2.3 病理標(biāo)本的制作 分別在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周深度麻醉下，隨機(jī)摘除6只BN大鼠的雙眼眼球，使用二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate，DEPC)處理過的蒸餾水沖洗，置于40 g·L－1多聚甲醛-0.1 mol·L－1PBS-DEPC 液中固定2 h。梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊4℃保存?zhèn)溆?。眼球組織5 μm厚度連續(xù)切片，置于50℃ DEPC處理過的蒸餾水中展片，撈片，置烤箱37℃烤片12 h后，4℃保存，備用做HE染色、免疫組織化學(xué)檢測及原位雜交檢測。400倍顯微鏡下觀察CNV生長情況，免疫組織化學(xué)方法檢測 NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)及VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，并測量不同時(shí)期CNV面積。

1.2.4 NF-κB與MCP-1的免疫組織化學(xué)檢測 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水;體積分?jǐn)?shù)30%H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;微波中火加熱15 min進(jìn)行抗原微波爐熱修復(fù);免疫組織化學(xué)檢測步驟依照試劑盒說明書進(jìn)行，分別滴加一抗兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體(1∶70)和小鼠抗大鼠的NF-κB單克隆抗體(1∶70)，4℃過夜;滴加 AEC顯色劑，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(3～10 min);蘇木素輕度復(fù)染 10 s，水溶性封片劑封片。0.01 mmol·L－1的 PBS 取代一抗孵育，作為陰性對照，試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。切片內(nèi)被染成紅色的點(diǎn)或團(tuán)簇為陽性反應(yīng)物。400倍光鏡下，選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片，對每張切片的NF-κB與MCP-1蛋白表達(dá)的免疫著色I(xiàn)OD值進(jìn)行測量，取5張切片的平均IOD值作為每個(gè)標(biāo)本的觀察值，并觀察CNV生長及細(xì)胞浸潤情況。

1.2.5 VEGF的原位雜交檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟至 DEPC水;體積分?jǐn)?shù) 30%H2O2室溫作用 10 min，滅活內(nèi)源性酶;切片上滴加30 g·L－1胃蛋白酶室溫消化10 min暴露mRNA片段;10 g·L－1多聚甲醛 0.1 mol·L－1PBS-DEPC 室溫固定 10 min;滴加20 μL預(yù)雜交液，于雜交濕盒中40℃預(yù)雜交3 h;滴加含VEGF寡核苷酸標(biāo)記探針的雜交液20 μL，原位雜交專用蓋玻片蓋在玻片上，置濕盒中于42℃雜交18 h，依照試劑盒說明書進(jìn)行雜交;AEC室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蘇木素復(fù)染20 s，GVA水溶性封片劑封片。呈團(tuán)簇、點(diǎn)狀的紅色著色為陽性。用不含探針的雜交液進(jìn)行雜交作為陰性對照，試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。400倍光鏡下，選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片，對每張切片的VEGF mRNA陽性著色的IOD值進(jìn)行測量，取5張切片的平均IOD值作為每個(gè)標(biāo)本的觀察值，并觀察CNV生長及細(xì)胞浸潤情況。

1.3 圖像分析與數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用 Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)對NF-κB、MCP-1蛋白表達(dá)的陽性著色及VEGF mRNA的陽性著色、CNV面積、FFA檢查結(jié)果(IOD值)進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)測試指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以表示，不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)組內(nèi)差異的顯著性情況用單因素方差分析，組間兩兩比較用 S-N-K檢驗(yàn)。同時(shí)，分別對NF-κB 蛋白與 MCP-1、VEGF mRNA、CNV 面積、FFA檢查結(jié)果(IOD值)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 光凝后不同時(shí)間點(diǎn) CNV面積及 FFA(IOD值)情況 由BN大鼠的病理切片可見，正常BN大鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，光凝后1周可見Bruch膜破裂，少量CNV形成，之后CNV面積逐漸增加，至光凝后8周可見明顯CNV形成(圖1)，不同時(shí)間點(diǎn) CNV面積間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05;見表1)。FFA檢查結(jié)果示，光凝后早期可見在激光光凝損傷區(qū)小的、沿光凝斑較淡的云霧狀熒光滲漏，2周后熒光滲漏明顯增強(qiáng)，之后熒光滲漏擴(kuò)散，表現(xiàn)為晚期強(qiáng)熒光。不同時(shí)間點(diǎn)熒光滲漏的IOD值檢測結(jié)果表明，隨時(shí)間推移IOD呈逐漸增加趨勢(表1)。

2.2 光凝后不同時(shí)間點(diǎn) NF-κB蛋白、MCP-1和VEGF mRNA的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，NF-κB蛋白在光凝后1周即有表達(dá)，主要表達(dá)于CNV組織中的色素上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，之后表達(dá)逐漸增多，至8周時(shí)達(dá)到高峰(圖2);IOD檢測結(jié)果顯示，光凝后不同時(shí)間點(diǎn)間NF-κB蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05;見表2)。光凝后1周MCP-1呈微弱點(diǎn)狀表達(dá)，之后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至第8周時(shí)達(dá)到高峰(圖3，表2)。原位雜交檢測結(jié)果表明，VEGF mRNA的表達(dá)主要位于CNV的新生血管組織中，可見紅色的陽性表達(dá)物隨時(shí)間延長逐漸增加，不同時(shí)間點(diǎn)間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05;見表2)。

Figure 1 Changes of CNV after photocoagulation.A:At 1 week after photocoagulation，broken bruch membrane could be obviously seen，a small amount of CNV formed;B:At 8 weeks after photocoagulation，CNV obvious formed 光凝后CNV的變化。A:光凝后1周，可見Bruch膜破裂，少量CNV形成;B:光凝后8周，可見明顯的CNV形成

Figure 2 Expression of NF-κB in CNV.A:At 1 week after photocoagulation，NF-κB in CNV tissues weakly expressed and scattered;B:At 8 weeks after photocoagulation，NF-κB expression reached the peak NF-κB蛋白在CNV中的表達(dá)。A:光凝后1周，NF-κB在CNV組織中散在微弱表達(dá);B:光凝后8周，NF-κB表達(dá)達(dá)到高峰

Figure 3 Expression of MCP-1 in CNV.A:At 1 week after photocoagulation，MCP-1 protein was weakly expressed;B:At 8 weeks after photocoagulation，MCP-1 expression reached the peak MCP-1蛋白在CNV中的表達(dá)。A:光凝后1周MCP-1呈微弱點(diǎn)狀表達(dá);B:光凝后8周，MCP-1表達(dá)達(dá)到高峰

表1 不同時(shí)間點(diǎn)CNV面積和FFA檢查結(jié)果Table 1 Changes of CNV area and FFA(IOD)at different time points after photocoagulation(，n=6)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)CNV面積和FFA檢查結(jié)果Table 1 Changes of CNV area and FFA(IOD)at different time points after photocoagulation(，n=6)

Note:Compared with previous group，*P ＜0.05

Time CNV area(S/μm2)IOD 1 week 3981.42±608.07 268.38±61.91 2 weeks 4864.28±146.80* 557.88±94.58*3 weeks 5381.77±170.64* 663.30±69.13*4 weeks 6122.99±202.08* 718.12±33.14 5 weeks 6631.10±517.24* 828.66±40.75*6 weeks 7448.10±423.42* 872.87±64.63 7 weeks 9368.43±435.50* 906.57±40.19 8 weeks 10 470.63±353.90*967.57±33.78

表2 不同時(shí)間點(diǎn) NF-κB蛋白、MCP-1和 VEGF mRNA的表達(dá)變化Table 2 Changes of NF-κB，MCP-1，VEGF mRNA expression at different time points after photocoagulation (，n=6)

表2 不同時(shí)間點(diǎn) NF-κB蛋白、MCP-1和 VEGF mRNA的表達(dá)變化Table 2 Changes of NF-κB，MCP-1，VEGF mRNA expression at different time points after photocoagulation (，n=6)

Note:Compared with previous group，*P ＜0.05

Time NF-κB MCP-1 VEGF mRNA 1 week 14.50±3.47 11.96±4.87 16.72±4.22 2 weeks 31.48±8.37* 58.23±8.94* 60.64±6.49*3 weeks 55.21±12.02* 100.04±12.73* 81.83±13.15*4 weeks 89.89±12.76* 130.09±4.71* 116.41±11.42*5 weeks 125.42±7.35* 180.02±10.24* 151.35±12.63*6 weeks 174.57±9.03* 330.31±15.11* 212.92±12.92*7 weeks 215.26±11.33* 390.51±11.97* 322.01±9.88*8 weeks 379.96±12.66* 421.88±9.13* 417.41±18.66*

2.3 相關(guān)性分析 將NF-κB蛋白表達(dá)情況與CNV面積、MCP-1、VEGF mRNA及FFA(IOD)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB蛋白與上述各因素間均呈顯著正相關(guān)(r=0.951、0.924、0.976、0.824，均為 P ＜0.05)。

3 討論

NF-κB是一個(gè)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛的生物學(xué)活性。1986年，Sen和 Baltimore首先從 B淋巴細(xì)胞核抽提物中檢出 NF-κB，它是可與免疫球蛋白的輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合的核蛋白因子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的二聚體是 p50/RelA異源二聚體，也稱NF-κB。NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)可接受多種免疫刺激，細(xì)胞漿中NF-κB/IκB 復(fù)合物中 IκB 磷酸化而與 NF-κB 解離，繼而NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，作用于靶基因，迅速誘導(dǎo)基因的表達(dá)，并產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)。NF-κB作為具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如趨化因子和酶的表達(dá)調(diào)控，防止凋亡和死亡，以及編碼血管形成因子或黏附分子等的基因調(diào)控［5-7］。目前的研究表明，NF-κB可能對血管形成具有核心的調(diào)節(jié)作用［7-8］。盡管目前對 NF-κB在新生血管形成中的參與機(jī)制還沒有詳細(xì)的闡明，但現(xiàn)有證據(jù)表明NF-κB在毛細(xì)血管形成中起到一定作用，并且它也是視網(wǎng)膜新生血管形成的必要因子［6-9］。

NF-κB總是被缺氧誘導(dǎo)［5］，Yoshida 等［10］和Hammes等［11］在視網(wǎng)膜新生血管模型中研究發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜血管主要供應(yīng)視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)，在視網(wǎng)膜相對缺氧狀態(tài)下，NF-κB主要在視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)纖維層的膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。缺氧是缺血性視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)性黃斑變性患者中CNV的共同啟動(dòng)因素。在本實(shí)驗(yàn)的BN大鼠CNV模型中，激光光凝導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮，故引起RPE、外層視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織的缺血缺氧。我們在BN大鼠的眼球組織切片中，采用小鼠抗大鼠的NF-κB單克隆抗體檢測其表達(dá)定位，在正常的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜組織中幾乎不能檢測到NF-κB的表達(dá)，而CNV組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、增生的色素上皮細(xì)胞及少量的視網(wǎng)膜外顆粒層組織均有NF-κB的表達(dá)。除了損傷區(qū)的缺血缺氧致NF-κB表達(dá)增加外，直接的激光損傷導(dǎo)致的在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織中的防御和修復(fù)反應(yīng)，也引起了NF-κB的表達(dá)增加。在1～8周內(nèi) NF-κB的表達(dá)與 CNV面積、FFA(IOD)、VEGF mRNA 呈正相關(guān)，揭示 NF-κB在CNV的形成中起了重要作用。這點(diǎn)與以往報(bào)道［12］結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中，NF-κB除在增生的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)外，也在遷移增生的色素上皮細(xì)胞中表達(dá)，我們推測NF-κB可能介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞的增生。有研究者在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，NF-κB反義寡核苷酸和 PDTC(NF-κB活化的抑制劑)可以抑制新生血管形成［6］。因此我們推測，NF-κB為治療視網(wǎng)膜新生血管及CNV提供了一個(gè)干預(yù)點(diǎn)。還有實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)在激光誘導(dǎo)的小鼠CNV中，姜黃素降低了MCP-1的表達(dá)及NF-κB的活化，抑制了 CNV 的形成［13］。

NF-κB對于毛細(xì)血管的形成是很重要的，盡管不能確定到底是在哪一步依賴于 NF-κB，但是 NF-κB對于抑制凋亡是必需的，許多黏附分子的激活也需要 NF-κB。此外，NF-κB可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶和VEGF受體flk-1的表達(dá)，對VEGF可能有正向調(diào)節(jié)作用［14-15］，VEGF基因包含轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 和AP-1 的識別位點(diǎn)［16］。Shono 等［6］研究證實(shí) NF-κB可以在體外調(diào)節(jié)新生血管形成，這進(jìn)一步證明了NF-κB的強(qiáng)有力的促血管形成功能。在本實(shí)驗(yàn)研究中，可見VEGF mRNA的基因表達(dá)主要位于CNV中的新生血管組織內(nèi)，且在CNV發(fā)展的8周內(nèi)，呈逐漸增加的趨勢，隨NF-κB蛋白表達(dá)的增強(qiáng)而增強(qiáng)，二者的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，說明VEGF在缺氧狀態(tài)下可在眼內(nèi)組織中表達(dá)，且NF-κB的活化對于它的表達(dá)是必要的。此外，NF-κB正向調(diào)節(jié) VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平，VEGF反過來又能增強(qiáng) NF-κB的結(jié)合能力，共同促進(jìn)新生血管的形成［1］。

MCP-1是已知最有效的巨噬細(xì)胞趨化因子，主要由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞［17-18］產(chǎn)生，但幾乎所有的細(xì)胞和組織經(jīng)適當(dāng)刺激后均能產(chǎn)生MCP-1。細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下，NF-κB 活化引起 MCP-1的產(chǎn)生增加［19］。本研究證實(shí)，MCP-1主要在CNV的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍及色素上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞周圍表達(dá)，并且隨時(shí)間推移而增加。MCP-1參與了炎癥細(xì)胞在CNV部位的聚集，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图笆中g(shù)剝離的CNV中已經(jīng)證實(shí)巨噬細(xì)胞存在于CNV的基質(zhì)中［20］，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子和生長因子參與了血管形成和CNV的細(xì)胞移行。大量巨噬細(xì)胞和增生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞浸潤在CNV組織中，與MCP-1的表達(dá)增加有一定關(guān)系。Shyy等［21］曾報(bào)道，MCP-1基因的5’側(cè)翼序列區(qū)有幾個(gè)作用元件與NF-κB的結(jié)合基序具有同源性。NF-κB一旦活化，可以產(chǎn)生信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致磷酸化和 IκB降解;NF-κB在擺脫了 IκB后，可以易位到細(xì)胞核內(nèi)，引起MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果可見，光凝后1～8周 MCP-1的表達(dá)與 NF-κB呈正相關(guān)。

Jo等［22］采用以脂質(zhì)體為載體視網(wǎng)膜下注射的方法在實(shí)驗(yàn)性CNV中轉(zhuǎn)染，以對抗NF-κB在核內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的順式作用元件的“decoy”(一段雙鏈磷硫寡核苷酸)，成功地將“decoy”轉(zhuǎn)染到 CNV的色素上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。FFA顯示激光誘導(dǎo)的CNV的形成被抑制。表明以 NF-κB為靶點(diǎn)的“decoy”是一個(gè)很有效的治療新生血管的方法。Hara等［23］利用小鼠CNV模型中腹腔注射N-乙酰半胱氨酸，發(fā)現(xiàn)可以抑制NF-κB活化從而抑制CNV形成。

總之，NF-κB可激活前炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞間黏附分子等的靶基因，上調(diào)這些細(xì)胞因子的表達(dá)，這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物又反過來激活 NF-κB，從而形成惡性循環(huán)加重局部和全身炎癥反應(yīng)［23］，NF-κB 在 CNV 中表達(dá)持續(xù)增加，可能在 CNV的起始和發(fā)展中起了很重要的作用。

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