王雪瑩， 李照梅， 周運(yùn)生， 郭文莉， 王鳳澤△

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等多種生命活動(dòng)過(guò)程［1-2］。PI3K和其下游分子蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)所構(gòu)成的信號(hào)途徑與腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移、自噬以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等關(guān)系密切［3］。抑制PI3K/Akt途徑的過(guò)度活化可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長(zhǎng)［4］。因此，PI3K/Akt已經(jīng)成為一個(gè)很有希望的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。MK-2206是Akt的新型抑制劑，表現(xiàn)出良好的抑制多種腫瘤的活性［5-6］。本研究以骨肉瘤細(xì)胞U2OS為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)MK-2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬的影響，為MK-2206的臨床用藥提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞株和主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

MK-2206購(gòu)自Selleck Chemicals;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco;MTT和氯喹購(gòu)自Sigma;DNA片段末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche;ECL試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific Pierce;Caspase-3抗體、caspase-9抗體、PARP抗體和Atg5抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;β-actin和LC3-II抗體購(gòu)自Sigma;Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋。

2 方法

2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 將U2OS細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同劑量的MK-2206處理24 h，對(duì)照組加入DMSO;終止培養(yǎng)前4 h加20 μL MTT(5 g/L)于各個(gè)孔中，吸去培養(yǎng)液并加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min后在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)MK-2206處理24 h后，PBS洗滌細(xì)胞3次，接著4℃固定細(xì)胞1 h，0.1%Triton X-100打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡染色，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果。

2.3 免疫印跡分析 細(xì)胞用RAPI裂解液冰上裂解20 min，然后4℃、13 000×g離心20 min，收集上清定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗室溫孵育2 h，接著加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3融合蛋白的表達(dá) 將GFPLC3質(zhì)粒和Lipofectamine 2000以適當(dāng)?shù)谋壤♂層跓o(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后室溫孵育30 min，然后加入經(jīng)Opti-MEM洗滌后的U2OS細(xì)胞中。在5%CO2孵箱內(nèi)37℃孵育6 h后更換新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，加入不同濃度的MK-2206繼續(xù)處理24 h，然后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MK-2206顯著抑制U2OS細(xì)胞活性

用不同劑量的MK-2206處理U2OS細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活性受到明顯的抑制，且MK-2206對(duì)U2OS細(xì)胞活性的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.MK-2206 reduced the viability of U2OS cells.The cells were seeded at a density of 1×109cells/L in 96-well culture plates at 37℃for 1 d.After 24 h of incubation，the cells were incubated with MK-2206 for 24 h and then processed for MTT assay.Mean±SD.n=6.圖1 MK-2206降低U2OS細(xì)胞的活力

2 MK-2206誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡

TUNEL結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞U2OS經(jīng)MK-2206作用24 h后，細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effect of MK-2206 on the apoptosis of U2OS cells.The cells were treated with different concentrations of MK-2206 for 24 h.The apoptosis was analyzed by TUNEL staining.The results showed the presence of fragmented DNA(TUNEL-positive staining，bright green in color)in MK-2206-treated U2OS cells.圖2 MK-2206誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡

免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠促進(jìn)U2OS細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9和PARP的活性切割，見(jiàn)圖3，表明 MK-2206誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡與激活caspases家族成員的活性密切相關(guān)。

Figure 3.MK-2206 treatment induced the cleavage of caspase-3，caspase-9 and PARP at 24 h.β-actin was used as a control.CF:cleaved fragment.圖3 MK-2206誘導(dǎo)caspase-3、caspase-9和PARP發(fā)生活性切割

3 MK-2206誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞發(fā)生自噬

轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的U2OS細(xì)胞經(jīng)MK-2206作用后，細(xì)胞內(nèi)LC3呈現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀聚集，而對(duì)照組綠色熒光呈彌散分布，見(jiàn)圖4。

用免疫印跡法檢測(cè)了MK-2206對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)LC3-II和Atg5蛋白表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MK-2206處理U2OS細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，LC3-II和Atg5的蛋白表達(dá)水平明顯增多，見(jiàn)圖5。

4 阻斷自噬促進(jìn)MK-2206對(duì)U2OS細(xì)胞活性的抑制作用

氯喹是一種自噬抑制劑，能有效抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)氯喹預(yù)處理后，MK-2206對(duì)U2OS細(xì)胞活性的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，見(jiàn)圖6。

討 論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑MK-2206能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但其在骨肉瘤細(xì)胞中的抑癌活性未見(jiàn)報(bào)道。本研究在檢測(cè)MK-2206降低U2OS細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)探討了MK-2206對(duì)細(xì)胞自噬的影響。本研究結(jié)果表明，MK-2206能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS的細(xì)胞活性，且抑制作用呈劑量依賴(lài)性;經(jīng) MK-2206作用24 h后，U2OS細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，調(diào)控細(xì)胞凋亡線(xiàn)粒體途徑的caspases家族部分蛋白出現(xiàn)明顯的活性切割。同時(shí)，我們觀察到自噬標(biāo)記分子LC3-II的表達(dá)水平升高，提示MK-2206可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬;GFP-LC3細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀分布進(jìn)一步證實(shí)了MK-2206能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生。

Figure 4.Induction of autophagy in MK-2206-treated U2OS cells.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated and GFP-LC3-transduced cells was observed.MK-2206 induced the redistribution of GFP-LC3 from diffused distribution(control cells)to punctate structures(MK-2206-treated cells).圖4 MK-2206對(duì)U2OS細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用

Figure 5.MK-2206 increased the expression of LC3-II and Atg5 in the U2OS cells.Cells were treated with indicated concentrations of MK-2206 for 24 h and then subjected to detect the levels of LC3-II and Atg5 by Western blotting.Bands were analyzed by Glyco Band-Scan software.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖5 MK-2206促進(jìn)U2OS細(xì)胞內(nèi)LC3-II和Atg5的表達(dá)

Figure 6.The effects of autophagic inhibitor chloroquine(CQ)on MK-2206-reduced cell viability.The cells were treated with 20 μmol/L CQ for 2 h before the addition of MK-2206 at concentration of 10 μmol/L(MK10)or 20 μmol/L(MK20).The cell viability was determined by MTT assay after 24h.Mean±SD.n=6.圖6 MK-2206聯(lián)合自噬抑制劑氯喹對(duì)細(xì)胞活性的影響

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞所特有的一種生物學(xué)過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過(guò)程的統(tǒng)稱(chēng)［7-8］。細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，自噬體與溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體，后者可降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器，同時(shí)循環(huán)利用降解的產(chǎn)物，為細(xì)胞代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及原料。近年來(lái)的研究顯示，自噬在腫瘤的預(yù)防治療中有重要作用。自噬與細(xì)胞凋亡關(guān)系復(fù)雜，表現(xiàn)在自噬既可誘導(dǎo)凋亡，又可拮抗細(xì)胞的凋亡，自噬的這種雙重作用機(jī)制使其在腫瘤細(xì)胞中的功能尤為重要［9-10］。

為了探討MK-2206誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞自噬與細(xì)胞活性的相關(guān)性，我們應(yīng)用自噬特異抑制劑氯喹來(lái)觀察自噬的發(fā)生對(duì)MK-2206抑制細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，經(jīng)氯喹預(yù)處理后，MK-2206對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用明顯增強(qiáng)，表明MK-2206誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能對(duì)U2OS細(xì)胞起保護(hù)作用。

綜上所述，MK-2206抑制人骨肉瘤U2OS細(xì)胞的活性與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)自噬相關(guān)。目前，自噬與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性尚未完全闡述清楚，對(duì)自噬的深入研究很可能為癌癥的治療提供新的途徑。MK-2206和自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可能為骨肉瘤的臨床治療提供新策略。

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