黃雪瓊， 檀衛(wèi)平， 吳葆菁， 藍 丹， 吳海飛， 麥賢弟

哮喘是兒童常見的氣道慢性炎癥性疾病。以吸入性糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合β2受體激動劑的傳統(tǒng)手段能較好控制大多數(shù)輕中度哮喘患者。而對于部分重癥患者，規(guī)范抗哮喘治療仍難以達到良好療效，其急診就診率和住院率分別為輕、中度哮喘患者的15倍和20倍，是增加哮喘治療費用的重要原因之一［1］。輔助性T細胞17(T helper 17 cells，Th17)/調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)失衡被證實在重度哮喘發(fā)病過程中起重要作用［2-3］。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為多能干細胞，具有多向分化性、高度增殖性、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)活性，成為近年來肺部疾病細胞治療的研究熱點［4］。本研究通過建立MSCs與重癥哮喘患兒外周血T淋巴細胞體外共培養(yǎng)體系，探討MSCs對Th17和Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，從而為以MSCs為基礎的哮喘防治提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 研究對象

入選病例為2012年10月～2013年10月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院兒科哮喘?？崎T診急性發(fā)作期重度哮喘兒童20例，診斷標準均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中兒童支氣管哮喘診斷標準［5］。樣本采集均取得患兒家屬或法定監(jiān)護人的同意(簽署知情同意書并取得倫理委員會的同意)。

2 試劑及儀器設備

白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)和腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF β)ELISA試劑盒，購自武漢華美科技有限公司;Trizol試劑盒購自TaKaRa;ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase試劑盒和Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒均購自ABI;所有引物均由生工生物工程有限公司合成。ABI Cycler PCR儀;ABI Step One RT-PCR儀。

3 主要方法

3.1 骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 肝素抗凝的健康成人骨髓10 mL，用等體積含15% 胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的L-DMEM培養(yǎng)液稀釋吹打混勻，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第3～5天首次換液，此后每3 d換液1次。當細胞達80%融合單層后傳代，細胞傳代用含10%FCS的L-DMEM培養(yǎng)液。

取第3代和第5代 MSCs，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化成單細胞懸液，以PBS緩沖液洗滌3遍，調(diào)整細胞密度為1×109/L，分別加入光標記的抗體:anti-CD34-FITC、anti-CD45-FITC、anti-CD29-PE和anti-CD105-FITC，振蕩混勻后室溫下避光孵育15 min，應用流式細胞術分析樣本中細胞相應標記抗原的陽性表達率。

3.2 外周血T淋巴細胞(T lymphocytes，TLC)的分離及培養(yǎng) 抽取入選研究對象的外周靜脈血4 mL(EDTA抗凝)，PBS等體積稀釋，緩慢加入Ficoll淋巴細胞分離液上，2 500 r/min離心20 min;吸取中間白膜層，以PBS充分洗滌后，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清后，加入RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×109/L。37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后，吸取懸浮細胞為TLC。

3.3 CCK-8法檢測MSCs對TLC增殖的影響 第3 ～5代的 MSCs經(jīng)消化、計數(shù)后，按100 μL/well接種于96孔板，每組3個復孔，72 h待其貼壁后，經(jīng)絲裂霉素C(25 μg/L)孵育30 min后，換為常規(guī)培養(yǎng)液;實驗分為4個組:陰性對照組:TLC以2×105/L單獨培養(yǎng)，未予植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激;陽性對照組:等量 TLC經(jīng) PHA刺激轉(zhuǎn)化(50 μg/L);MSCs組:按每孔2 ×104、1 ×104、2 ×103和1×103個細胞密度接種MSCs于96孔板內(nèi);實驗組:PHA 刺激下 MSCs與 TLC 按不同比例(1∶1、1∶2、1∶10和1∶20)直接接觸共培養(yǎng)。72 h后加入CCK-8 10 μL/well，繼續(xù)孵育 2 h，在 450 nm 波長處，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度(A)值，并計算TLC增殖抑制率:1-(共培養(yǎng)組A值-MSCs組A值)/陽性對照組A值×100%。實驗重復3次。

3.4 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-17和TGF-β的含量 收集1∶2比例共培養(yǎng)體系培養(yǎng)上清及TLC單獨培養(yǎng)上清，按IL-17和TGF-β定量檢測試劑盒操作，每個樣本和標準品均設2個復孔，記錄酶標儀492 nm處數(shù)據(jù)。

3.5 qRT-PCR檢測維甲酸相關孤兒核受體(retinoic acid-related orphan nuclear receptor C，RORC)及叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)mRNA表達收集1∶2比例共培養(yǎng)體中懸浮細胞及TLC單獨培養(yǎng)細胞，采用Trizol法提取RNA，ABI Script RT Kit合成cDNA，引物序列見表1。根據(jù)Real Master Mix(含SYBR Green I)配置PCR反應體系，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結(jié)束，設定最佳閾值，獲取擴增循環(huán)數(shù)(Ct值)，根據(jù)標準曲線和斜率，用公式2-ΔΔCt方法進行相對定量，計算得出目的基因相對于管家基因GAPDH的量。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件處理，正態(tài)分布定量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗或方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 MSCs的形態(tài)和表型

傳代培養(yǎng)的MSCs為成纖維細胞樣，形態(tài)均一、旋渦狀生長。流式細胞儀檢測第3和5代MSCs表面分子，絕大部分細胞均表達CD29和CD105，不表達 CD34 和 CD45，見圖 1、2。

Figure 1.The 3rd passage of MSCs.A:×40;B:×100.圖1 第3代骨髓間充質(zhì)干細胞

Figure 2.Surface markers of CD29，CD105，CD45 and CD34 in MSCs.圖2MSCs表型鑒定CD29、CD105、CD45及CD34

2 MSCs對TLC體外誘導增殖的影響

PHA刺激下MSCs與TLC共培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察到共培養(yǎng)組TLC生長稀疏，增殖受限，見圖3。CCK-8法結(jié)果提示:4組不同濃度MSCs對TLC增殖的抑制具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著MSCs濃度的增高，其抑制能力逐步增強，見表2。

Figure 3.MSCs cocultured with TLC.A:×40;B:×100.圖3MSCs與TLC共培養(yǎng)

3 MSCs對重度哮喘患兒外周血IL-17及TGF-β表達水平的影響

MSCs+TLC共培養(yǎng)組IL-17表達水平較TLC單獨培養(yǎng)組降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而共培養(yǎng)后TGF-β表達水平明顯升高，差別具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表3。

4M SCs對重度哮喘患兒外周血RORC mRNA及Foxp3 mRNA表達水平的影響

MSCs+TLC共培養(yǎng)組RORC mRNA表達水平較TLC單獨培養(yǎng)組明顯減低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);共培養(yǎng)組Foxp3 mRNA表達與TLC單獨培養(yǎng)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

討 論

重度哮喘是一種免疫紊亂的變態(tài)反應性疾病，常表現(xiàn)為持續(xù)性氣道炎癥、氣道重塑及糖皮質(zhì)激素抵抗性，常規(guī)治療效果欠佳。近年來，淋巴細胞亞群Th17/Treg失衡作為重度哮喘發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)受到廣泛關注。課題組以往資料顯示，重度哮喘患兒體內(nèi)Th17細胞過度活化，占優(yōu)勢地位，而Treg細胞數(shù)目相對減少及功能低下導致Th17/Treg失衡，加重哮喘的發(fā)生發(fā)展，與哮喘氣道重塑密切相關［6-7］。 Th17與Treg細胞的分化成熟分別受其上游轉(zhuǎn)錄因子RORC及Foxp3表達水平調(diào)控，而IL-17與TGF-β則分別是二者重要的效應因子。通過調(diào)控Th17/Treg之間的平衡，恢復免疫自穩(wěn)狀態(tài)，緩解炎癥反應，將為哮喘的治療提供新思路。

表2 MSCs對PHA刺激下TLC增殖的影響Table 2.Effect of MSCs on the proliferation of T lymphocytes(TLC)stimulated by PHA(Mean±SD.n=9)

表3 2組培養(yǎng)上清IL-17及TGF-β的分泌情況Table 3.Secretion of IL-17 and TGF-β in supernatants of the 2 groups(ng/L.Mean±SD.n=20)

表4 重度哮喘患兒外周血RORC及Foxp3 mRNA表達Table 4.The mRNA expression of RORC and Foxp3 in children with severe bronchial asthma(Mean±SD.n=20)

MSCs廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有強大的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛應用于炎癥性疾病和自身免疫疾病的動物實驗及臨床研究中［8-10］。本實驗通過MSCs與重度哮喘患兒外周血TLC的共培養(yǎng)，探討MSCs對Th17和Treg細胞效應因子IL-17、TGF-β 及轉(zhuǎn)錄因子 RORC、Foxp3 mRNA表達的影響。

近年研究表明，MSCs在體外能夠有效抑制TLC的增殖反應。Djouad等［11］證實MSCs能明顯抑制共培養(yǎng)體系中TLC的增殖活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效和時效正比關系。本實驗結(jié)果表明，MSCs對PHA刺激下重度哮喘患兒外周血TLC增殖具有顯著抑制作用，且隨著MSCs數(shù)量的增加，抑制作用也同步增強，具有一定的劑量依賴性，與大多數(shù)研究相符合。

以往研究顯示，MSCs在不同體外培養(yǎng)環(huán)境對TLC的免疫調(diào)節(jié)作用不盡相同。Ghannam等［12］研究發(fā)現(xiàn)MSCs不僅能抑制原始CD4+T細胞向Th17細胞方向分化，減少IL-17和IL-22水平，并且通過誘導Foxp3的轉(zhuǎn)錄增加Treg細胞數(shù)量，從而發(fā)揮抗炎作用。而 Kapoor等［13］將過敏性哮喘患者的外周血單個核細胞給予螨蟲致敏后，與MSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs減少IFN-γ、上調(diào)IL-10水平的同時，Treg細胞數(shù)量沒有明顯改變，成熟樹突狀細胞反而明顯增加，提示MSCs可能通過促進成熟樹突狀細胞而非Treg細胞的生成達到抗炎效果。本實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs與PHA刺激下重度哮喘患兒外周血TLC直接接觸共培養(yǎng)后，Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA和效應因子IL-17均表達減少，提示MSCs可能通過抑制Th17細胞定向分化并下調(diào)IL-17的分泌，進而減少重度哮喘患兒體內(nèi)的中性粒細胞炎癥反應。另外我們還發(fā)現(xiàn)，MSCs上調(diào)TGF-β水平的同時，對Treg細胞調(diào)控基因Foxp3 mRNA表達并無明顯影響，證實了TGF-β是MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要因子。本研究顯示，MSCs對重度哮喘患兒的免疫調(diào)節(jié)作用并非通過上調(diào)Treg細胞的定向分化，可能通過高分泌TGF-β來抑制T、B淋巴細胞的增殖及巨噬細胞的活化，抑制CD4+T細胞亞群向Th17方向極化，從而糾正Th17/Treg失衡。

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