謝英花， 馬燕山， 張 楠， 張建新△

我國(guó)每年心血管疾病占總死亡原因的41%［1］。其中缺血性心臟病可引發(fā)自由基損傷、鈣超載、炎癥瀑布反應(yīng)等，進(jìn)而誘發(fā)心絞痛，甚至心肌梗死［2］。此類心臟病防治的重點(diǎn)是如何解除或減輕缺血性損傷。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)炎癥損傷在缺血性心肌病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［3-4］。研究表明H2S在心肌缺血/再灌注模型中發(fā)揮抗炎作用［5-6］。但其對(duì)離體急性心肌缺血損傷的影響與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系，目前尚不明確。本研究采用離體大鼠急性缺血損傷模型，觀察H2S對(duì)急性缺血時(shí)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子的影響，探討H2S的心肌保護(hù)作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 儀器、藥品與試劑 NaHS購(gòu)自Sigma;Prime-Script RT Reagent(Prefect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqTM(Prefect Real Time)、RNAiso Plus Reagent、EASY Dilution(for Real Time PCR)和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa;BCA法蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白marker均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;鼠NF-κB p65和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。八道生理記錄儀PowerLab/8S(AD Instrument);PCR Thermal Cycler Dice和PCR Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa);凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

1.2 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)♂SD大鼠40只，體重(270±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為:假手術(shù)組(sham)、缺血組(ischemia)以 及 NaHS 5 μmol/L、10 μmol/L 和20 μmol/L劑量組。假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線但不結(jié)扎。缺血組建立缺血模型。NaHS各劑量組亦制備缺血模型，缺血2 h時(shí)更換為5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L NaHS灌流液。假手術(shù)組和缺血組用正常灌流液灌流。

2 方法

2.1 離體大鼠急性心肌缺血損傷模型的制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，迅速開胸，取出心臟，置于盛有混合氣飽和預(yù)冷K-H液的平皿中，清洗殘留血液，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管，懸掛于Langendorff灌注裝置，使用95%O2+5%CO2混合氣飽和的K-H液恒壓灌注，循環(huán)恒溫水浴維持灌注系統(tǒng)溫度在(37±0.5)℃。離體心臟經(jīng)Langendorff模型平衡灌注20 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌急性缺血。結(jié)扎成功后每分鐘冠脈流量下降30%左右，心肌收縮力下降至原來(lái)1/3～1/2，心臟缺血區(qū)表面發(fā)白。繼續(xù)灌流4 h。

2.2 心功能測(cè)定 記錄各組缺血末 ±dp/dtmax、左室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)和冠脈流量(coronary flow，CF)等心功能指標(biāo)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和ICAM-1 mRNA的表達(dá) 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟，用冰生理鹽水沖洗干凈，無(wú)菌環(huán)境下取部分左心室前壁組織，迅速放入超低溫冰箱中，留待進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定。

將冷凍組織100 mg在預(yù)冷好的研缽中研磨至粉狀。用RNAiso Plus 2 mL完全覆蓋樣品。室溫靜置。使之完全融化，后研磨直至得到透明裂解液。轉(zhuǎn)移勻漿液，室溫下靜置5 min。4℃、13 000 r/min離心5 min后，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管。按0.2 mL/1 mL的比例加入CHCl3，并振搖使之混勻。接著室溫靜置5 min，4℃、1 350 r/min離心15 min后，取 500μL上清，加入等體積的(CH3)2CHOH，混勻。室溫靜置10 min，4℃、13 000 r/min離心10 min。棄去上清液。用-20℃預(yù)冷的75%的乙醇1 mL清洗沉淀。后4℃、13 500 r/min離心5 min處理。棄去上清液，室溫放置干燥。沉淀用RNase Free dH2O 40 μL溶解，在-80℃冰箱中保存，備用。

配制RT反應(yīng)液(配制在冰上進(jìn)行)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可有效地將全長(zhǎng)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。配制real-time PCR反應(yīng)液(配制在冰上進(jìn)行)。GAPDH引物序列正義鏈 5′-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3′，反義鏈 5′-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3′;IL-6 引物序列 正 義 鏈 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAACTTCC-3′，反義鏈 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′;IL-1β 引物序列正義鏈 5′-GACCTGTTCTTTGAGGCTGACA-3′，反義鏈 5′-CTCATTGGACAGCCCAAGTC-3′;TNF-α 引物序列正義鏈 5′-CCCAGACCCTCACACTCAGAT-3′，反義鏈 5′-TTGTCCCTTGAAGAGAACCTG-3′;ICAM-1引物序列正義鏈5′-CCCCACCTACATACATTCCTAC-3′，反 義 鏈 5′-ACATTTTCTCCCAGGCATTC-3′;IL-10引物序列正義鏈 5′-CAGACCCACATGCTCCGAGA-3′，反義鏈 5′-CAAGGCTTGGCAACCCAAGTA-3′。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件:95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

Real-time PCR定量分析數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)收集，繪制動(dòng)力學(xué)曲線，測(cè)定每個(gè)樣品的Ct值，用2-ΔΔCt方法分析各組 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和 ICAM-1 mRNA表達(dá)的差異。

2.4 Western blotting半定量測(cè)定心肌組織NF-κB的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟，剪取左心室前壁部分組織，迅速放入超低溫冰箱中保存，留待進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。將裂解的心肌組織離心得沉淀，加核蛋白提取液，研磨，離心，上清液與點(diǎn)樣緩沖液熱變性，做聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用TBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的NF-κB p65Ⅰ抗，再加相應(yīng)的Ⅱ抗，ECL顯色，掃描條帶，轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像，ImageJ圖像分析軟件半定量分析蛋白條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，通過(guò)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 離體心肌組織心功能的變化

各組缺血末±dp/dtmax、LVDP、CF等心功能指標(biāo)見表1。結(jié)果表明，ischemia組心臟的 LVDP、±dp/dtmax和 CF均呈明顯下降(與 sham組相比，P＜0.01)。NaHS 5 μmol/L、10 μmol/L 和 20 μmol/L 組心臟的上述指標(biāo)均明顯高于ischemia組(P＜0.05或P＜0.01)，說(shuō)明H2S改善了離體急性缺血心肌功能。

表1 H2S對(duì)心功能的影響Table 1.The effect of H2S on the cardiac functions in the rat hearts after ischemia(Mean±SD.n=8)

2 H2S 對(duì)離體心肌組織中 TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-10和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

Ischemia 組離體心肌組織中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，IL-10 mRNA的表達(dá)明顯降低(與sham組相比，P＜0.01);與ischemia組相比，各 NaHS劑量組離體心肌組織中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表達(dá)顯著降低，10 μmol/L和20 μmol/L NaHS組離體心肌組織中IL-10 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1、2。

3 H2S對(duì)離體心肌組織中NF-κB表達(dá)的影響

Sham組離體心肌組織中僅有很少量NF-κB的表達(dá);ischemia組離體心肌組織中NF-κB的表達(dá)明顯升高(與sham組相比，P＜0.01);與ischemia組相比，10 μmol/L 和 20 μmol/L NaHS 組離體心肌組織中NF-κB的表達(dá)顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，見圖3。

Figure 1.Effects of H2S on the mRNA expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in rat myocardial tissues.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia.圖1 H2S對(duì)離體心肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

Figure 2.Effects of H2S on the mRNA expression of ICAM-1 and IL-10 in rat myocardial tissues. ＊＊P ＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia.圖2 H2S對(duì)離體心肌組織中ICAM-1和IL-10 mRNA表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of H2S on the protein level of NF-κB in rat myocardial tissues detected by Western blotting.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia.圖3 H2S對(duì)離體心肌組織中NF-κB表達(dá)的影響

討 論

本研究采用Langendorff離體灌流心臟和結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，成功復(fù)制大鼠急性心肌缺血損傷模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性缺血后，心肌收縮力減弱，心功能降低。NF-κB出現(xiàn)明顯移位，核NF-κB表達(dá)量明顯增加，并伴隨心肌組織中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，IL-10 mRNA表達(dá)明顯降低。而H2S能明顯對(duì)抗心肌缺血所致的LVDP降低，增加LVDP、±dp/dtmax及冠脈流量，抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，保護(hù)急性缺血心肌。

心肌急性缺血初期僅有部分心肌細(xì)胞壞死，但隨著大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到心肌組織梗死區(qū)，心肌細(xì)胞壞死和凋亡的范圍逐步擴(kuò)大，形成較大面積心肌梗死，加速心功能惡化。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌梗死后心臟病理學(xué)損傷的重要原因［7-8］。因此調(diào)控心肌梗死后炎癥反應(yīng)，恢復(fù)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，是減輕心肌梗死后心臟損傷的關(guān)鍵［9-10］。

NF-κB是一種活躍的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種炎癥遞質(zhì)及細(xì)胞因子基因的表達(dá)，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡中起關(guān)鍵作用。研究表明心肌梗死后缺氧、氧化應(yīng)激等活化信號(hào)能夠激活NF-κB，并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而誘導(dǎo)黏附分子家族的ICAM-1，前炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 等的表達(dá)上調(diào)［9］，導(dǎo)致心肌炎癥反應(yīng)，引起心肌缺血損傷。而若能抑制NF-κB的活化和表達(dá)，可抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心臟修復(fù)［11］。IL-lβ是IL-1的亞型之一，發(fā)生心肌缺血時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞具有直接的毒性作用，并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附［12］。IL-6是炎癥反應(yīng)中的核心調(diào)節(jié)因子，可廣泛作用于多個(gè)系統(tǒng)。ICAM-1表達(dá)升高會(huì)增加中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏附，并可進(jìn)一步惡化，加重心肌組織細(xì)胞損傷［13］。TNF-α是重要的初級(jí)炎癥因子，在應(yīng)激狀態(tài)下，可在心肌大量表達(dá)［12］。而IL-10為多功能、多細(xì)胞源性的炎癥抑制因子。若其產(chǎn)生受到抑制，促炎細(xì)胞因子將失去負(fù)反饋抑制作用，使炎癥不斷進(jìn)展和惡化［14］。NF-κB的激活在炎癥細(xì)胞因子表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，而且兩者相互促進(jìn)，所以調(diào)節(jié)NF-κB的活性將有利于改善炎癥反應(yīng)，抑制心室的重構(gòu)［15］。

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