王愛麗， 牛 瓊， 劉成霞， 賈興芳， 連海峰

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是各種原因導致組織器官缺血時，引起細胞代謝障礙和組織結構出現(xiàn)破壞，當血供恢復時，組織及細胞損傷反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象。小腸是缺血再灌注損傷最常累及的器官，腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況均會引起小腸的缺血性損傷。腸道黏屏障是防止腸道內有害物質和病原體進人機體內環(huán)境，并維持機體內環(huán)境穩(wěn)定的一道重要屏障，主要由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障四部分組成。在腸缺血再灌注損傷過程中，小腸局部微血管通透性增加、腸黏膜屏障功能受損，從而導致腸道細菌和毒素的移位，嚴重時可引發(fā)全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)［1］和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。文獻報道，在過去的幾十年中，醫(yī)院腸缺血發(fā)生率持續(xù)增加，急性腸缺血再灌注損傷病死率維持在一個較高的水平，大約在60% ～80%［2］。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是腸上皮細胞重要的營養(yǎng)物質，在腸道嚴重損傷的情況下可以增加小腸吸收面積，增加腸黏膜的細胞構成，減少內毒素升高［3］。本課題組前期的研究表明，谷氨酰胺對體外缺氧再灌注損傷的腸上皮細胞具有保護作用［4］。本研究擬利用大鼠建立腸缺血再灌注損傷模型，探討谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及其機制。

材料和方法

1 藥物和試劑

谷氨酰胺粉末，純度99%，購自Sigma;D-乳酸試劑盒購于慧嘉生物有限公司;內毒素試劑盒購于廈門鱟試劑實驗廠有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購于南京建成有限公司。

2 動物和分組

清潔級健康成年雄性Wistar大鼠(n=30)，體重220～250 g，由山東大學實驗動物中心提供，批號為SOXXK(魯)20090001。

動物隨機分為假手術(sham)組、I/R組和Gln組，每組10只。Gln組于造模前7 d開始給予1 g·kg-1·d-1谷氨酰胺連續(xù)灌胃，sham和I/R組分別于造模前給予同等劑量生理鹽水灌胃。所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉。Sham組取腹正中切口，長約3.0 cm，用溫鹽水紗布將腸管推向左側腹腔，暴露右腎內上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，分離 SMA后不阻斷。I/R組則顯露SMA，用無創(chuàng)血管夾阻斷其系膜血管30 min，造成腸缺血模型，松夾再灌注24 h。Gln組顯露SMA，余操作同I/R組。操作過程中所有大鼠腹腔注入37℃生理鹽水0.5 mL/kg，以保持血流動力學穩(wěn)定。實驗結束后關腹。

I/R 24 h后再次麻醉剖腹，立即從腹主動脈采集血標本，行全血4℃、3 000 r/min離心 20 min后分裝血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。剪取距回盲部約10 cm處4.0 cm長回腸標本，迅速用冷生理鹽水溶液沖洗，清除黏液、污物等腸腔內容物后，用濾紙吸干，立即投入裝有10%甲醛溶液中固定，以備HE染色行組織病理學檢測。

3 方法

3.1 腸黏膜絨毛組織病理變化的光鏡觀察 取距回盲部10 cm處4 cm腸段，用10%中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(厚5 μm)，HE染色。光鏡下觀察腸黏膜絨毛結構變化并進行Chiu′s評分。評分標準見表1。

表1 腸道損傷Chiu氏6級評分Table 1.Chiu′s scoring for evaluating intestinal injury

3.2 透射電鏡觀察細胞間機械屏障的變化 取距回盲部10 cm處4 cm腸段，2.5%戊二醛固定24 h以上;2%鋨酸固定2 h;丙酮梯度脫水;環(huán)氧樹脂混合液37℃浸泡24 h;純丙酮+包埋液(2∶1)室溫3～4 h、純丙酮+包埋液(1∶2)室溫過夜、純包埋液37℃ 2～3 h包埋，固化后，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色修塊、定位后制出超薄切片;透射電鏡觀察、照相。

3.3 血清SOD和MDA的檢測 采用硫代巴比妥酸法測定血清中MDA的含量;采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。試劑均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。操作步驟嚴格按照說明書進行。儀器采用上海產(chǎn)721型分光光度計，測定對照管及測定管的吸光度值，通過公式計算求出被測樣品的SOD活性及MDA水平。

3.4 大鼠血清內毒素的測定 應用ELISA試劑盒，將已知內毒素濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將內毒素和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的辣根過氧化物酶。再經(jīng)溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，與酶結合物同時作用，產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中內毒素的濃度呈比例關系。于545 nm波長處讀取吸光度值，建立標準曲線，測得樣品中內毒素的濃度。

3.5 大鼠血清中D-乳酸含量的測定 采用慧嘉生物公司D-乳酸酶聯(lián)免疫分析試劑盒，應用雙抗體夾心法測定血清中大鼠D-乳酸的水平。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A)，通過標準曲線計算樣品中大鼠D-乳酸的濃度。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。對符合正態(tài)分布和方差齊性的資料進行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。輸入SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠腸黏膜絨毛組織的病理變化

假手術對照組絨毛排列整齊，無水腫。腺體正常，上皮下間隙無擴大，固有層無水腫;缺血再灌注組主要表現(xiàn)為腸黏膜上皮缺失，伴腺體水腫，排列紊亂，固有層崩解，部分絨毛頂端出血;谷氨酰胺預處理組表現(xiàn)為腸黏膜絨毛上皮下間隙擴大，但不明顯，絨毛輕度水腫，腺體形態(tài)大致正常，固有層輕度水腫，見圖1。再灌注24 h的損傷程度(Chiu′s評分)，sham組:0.29±0.46;I/R組:4.10±0.50;Gln組:2.50±0.64。I/R組與sham組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Gln組與I/R組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Gln組與sham組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

Figure 1.Pathological changes of the rat intestinal mucosa observed by HE staining(×400).A:sham group;B:I/R group;C:Gln group.Scale bar=50 μm.圖1 各組大鼠腸黏膜絨毛組織的HE染色結果

2 透射電鏡觀察腸黏膜絨毛組織的病理變化

假手術對照組電鏡下腸黏膜上皮排列規(guī)則、緊密，多位斜切，上皮細胞呈高柱狀，上皮細胞表面微絨毛豐富，排列規(guī)則，細胞間靠腔面為緊密連接，下方為橋粒結構，緊密連接比較長，結構清晰，連接縫隙小，近游離面細胞器豐富，有大量線粒體分布，細胞側面連接復合體結構完整;缺血再灌注組電鏡下腸黏膜上皮細胞表面微絨毛較稀疏，排列欠規(guī)則，少數(shù)細胞微絨毛倒伏，細胞側面的連接復合體完整，細胞間靠腔面為緊密連接，下方為橋粒結構，緊密連接較正常組稍變短，橋粒結構良好，細胞內線粒體基本正常，粗面內質網(wǎng)脫顆粒，內質網(wǎng)腫脹;谷氨酰胺治療組電鏡下腸黏膜上皮細胞表面微絨毛密集、排列規(guī)則，緊密連接較長，結構清晰，連接縫隙小，橋粒結構豐富，細胞間的連接復合體完整，細胞器形態(tài)基本正常，見圖2。

Figure 2.Pathological changes of the rat intestinal mucosa observed under transmission electron microscope(×10 000).A:sham group;B:I/R group;C:Gln group.Scale bar=1 μm.圖2 透射電鏡觀察

3 谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷大鼠血清中D-乳酸和內毒素水平的影響

缺血再灌注組與假手術組相比，血清中D-乳酸和內毒素含量明顯升高(P＜0.05);谷氨酰胺治療組與缺血再灌注損傷組相比，血清中D-乳酸和內毒素含量顯著降低(P＜0.05)，見表2。

4 谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷大鼠血清SOD和MDA水平的影響

表2 各組大鼠血清中內毒素及D-乳酸的含量Table 2.The serum levels of endotoxin and D-lactic acid in the rats with different treatments(Mean±SD.n=10)

缺血再灌注損傷組與假手術組比較，SOD活性顯著降低，MDA水平顯著增高(P＜0.05)，谷氨酰胺治療組與缺血再灌注損傷組相比較，血清SOD活性高于缺血再灌注損傷組，MDA水平低于缺血再灌注組，見表3。

表3 各組大鼠血清SOD活性及MDA含量Table 3.Changes of SOD and MDA levels in the rats with different treatments(Mean±SD.n=10)

討 論

缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷、嚴重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程。小腸是對缺血再灌注損傷最敏感的器官之一，在腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會引起小腸的缺血性損傷，在組織恢復血供時，再灌注損傷會加重對小腸的損傷。同時，小腸是機體最大的細菌庫，缺血再灌注損傷消化道，削弱小腸的生理屏障功能，腸道黏膜屏障功能損傷的主要病理改變是腸黏膜通透性增加，從而導致內毒素血癥、腸內細菌移位，引起大量炎癥因子的釋放，誘導全身炎癥反應綜合癥和多器官功能不全綜合癥的發(fā)生［1，5］。

內毒素是G-菌細胞壁的脂多糖成分，是炎癥反應的主要觸發(fā)因素［6］。正常情況下，機體腸腔內含大量細菌和內毒素。由于腸道屏障功能完整，細菌和內毒素難以進入血循環(huán)，當腸道屏障功能障礙時，內毒素穿過腸黏膜，進入血液循環(huán)，形成內毒素血癥。D-乳酸是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，由腸道多種細菌產(chǎn)生，當腸道發(fā)生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，細胞旁路徑增加而致腸黏膜通透性增加時，腸道中細菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過受損黏膜入血，人體內缺乏D-乳酸脫氫酶，且其它替代途徑代謝緩慢，故監(jiān)測血中乳酸水平可反映腸黏膜損害程度和通透性變化［7］。

近來人們對腸缺血再灌注損傷的氧化應激機制有了更深入的認識［8-9］。小腸絨毛富含活性氧簇相關的酶，缺血再灌注激活了腺嘌呤-次黃嘌呤代謝途徑，使氧自由基的產(chǎn)生異常增加。生物膜主要由脂質、蛋白質和糖類組成，脂質以磷脂為主，磷脂的主要成分是多聚不飽和脂肪酸，其中有多個弱鍵和不飽和鍵，氧自由基對其有很高的親和力，過多的氧自由基可激發(fā)鏈式脂質過氧化反應，造成細胞膜性結構中脂類過氧化，抑制線粒體酶活性，使細胞膜、溶酶體膜通透性增加，導致細胞膨脹破裂，破壞腸黏膜結構和功能，導致腸黏膜通透性增高。當此反應鏈遇到谷胱甘肽、維生素E和維生素C等抗氧化物時損傷效應后就會終止。MDA是腸缺血再灌注損傷病理過程中一種代表性脂質過氧化物，其含量可直接反映機體內脂質過氧化的程度。SOD是體內清除氧自由基的最主要物質，其活力的高低反映了機體清除氧自由基的能力［10-12］。

谷氨酰胺是腸上皮細胞、淋巴細胞和巨噬細胞最重要和最易利用的能源燃料［13］，是抗氧化防御系統(tǒng)中重要物質谷胱甘肽和核苷酸等合成的前體。Wu等［14］研究表明，谷氨酰胺處理對腸缺血再灌注損傷腸黏膜具有保護作用，可以降低腸缺血再灌注過程中內毒素的升高［15］，降低細菌移位，減輕缺血再灌注損傷。但是，谷氨酰胺對腸黏膜的保護作用是否與抗氧化應激有關尚未明確。因此我們利用大鼠建立腸缺血再灌注損傷模型，探討谷氨酰胺對大鼠腸缺血再灌注損傷的作用及其機制。

本研究參照文獻［16］的方法制備小鼠腸缺血再灌注損傷模型，結果I/R組大鼠腸上皮細胞脫落，腺體明顯損傷，上皮下間隙增大，固有層水腫、充血、出血，提示大鼠腸缺血再灌注損傷模型制備成功。正常情況下腸黏膜具有完善的機械屏障，機械屏障由腸黏膜表面黏液、微絨毛、上皮細胞及其間的緊密連接以及黏膜的特殊結構組成［17］。我們通過電鏡下觀察腸黏膜的超微結構發(fā)現(xiàn)，與缺血組相比，模型組及谷氨酰胺組電鏡下腸黏膜上皮排列明顯規(guī)則、緊密，上皮細胞表面微絨毛豐富，排列較規(guī)則，細胞間腔面緊密連接明顯較長，結構清晰。我們通過測定腸缺血再灌注損傷大鼠腸道細菌代謝產(chǎn)物D-乳酸及血漿內毒素水平來了解其腸道屏障功能及腸通透性的變化。結果顯示，腸缺血再灌注損傷組大鼠腸黏膜屏障受損，血漿D-乳酸、內毒素水平較假手術組均明顯升高(P＜0.05)，提示大鼠在腸缺血再灌注狀態(tài)下，腸黏膜屏障功能障礙、腸通透性升高，并出現(xiàn)內毒素血癥。而谷氨酰胺處理組血漿D-乳酸、內毒素水平較對照組顯著降低(P＜0.05)，保護腸黏膜免受損傷，降低內毒素血癥的發(fā)生及細菌移位。與缺血再灌注損傷組相比，谷氨酰胺處理組MDA水平顯著降低，SOD活性顯著升高(P＜0.05)，提示谷氨酰胺可以抑制脂質過氧化反應，提高機體清除氧自由基的能力。由此可見，谷氨酰胺處理可以減低缺血再灌注損傷，該保護作用可能是通過清除氧自由基及提高組織抗氧化酶活力，減輕脂質過氧化而實現(xiàn)的。但谷氨酰胺使用方法、劑量以及協(xié)同效應等還需要進一步的探索研究，以徹底分析谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷的作用機制，從而為臨床工作提供指導。

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