韓銀淑

[摘要] 目的 本文通過(guò)研究染料木素（Gen）對(duì)體外培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞增殖以及PKA活性的影響，探討Gen抑制MGC-803細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制。方法 光鏡下觀察經(jīng)Gen處理后人胃癌MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用MTT法檢測(cè)Gen對(duì)體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖影響；PepTag法檢測(cè)Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，經(jīng)Gen處理后MGC-803細(xì)胞外形呈不規(guī)則狀、細(xì)胞間隙增大、折光性差；MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖，并且抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴(lài)性；濃度為40 μg/mL的 Gen可以顯著上調(diào)MGC-803細(xì)胞的PKA活性（P<0.01）。結(jié)論 Gen對(duì)人胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞的增殖有抑制作用，上調(diào)PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 染料木素；MGC-803細(xì)胞；PKA活性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）28-0001-03

染料木素（Genistein，Gen）是一種來(lái)源于大豆或其他豆科植物的大豆異黃酮，其具有類(lèi)雌激素、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等生物活性。流行病學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Gen能降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴(lài)型腫瘤的發(fā)生率，對(duì)激素依賴(lài)型腫瘤的預(yù)防和治療有一定的療效。此外，Gen對(duì)消化道腫瘤也有明顯的抑制作用，然而其抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚[3]。本文通過(guò)研究Gen對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖及PKA活性的影響，探討Gen抑制MGC-803細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制，為Gen在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系

人胃黏液性腺癌細(xì)胞株MGC-803由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。培養(yǎng)基選用RPMI-1640完全培養(yǎng)液，加10%滅活hyclon胎牛血清、100 IU/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。收集MGC-803細(xì)胞，稀釋至1×105/mL，接種于培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋了80%培養(yǎng)皿表面積時(shí)要傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 藥物與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclon產(chǎn)品；Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA為Sigma-Aldrich產(chǎn)品；PKA活性檢測(cè)試劑盒為Promega產(chǎn)品。Gen為陜西天行健生物化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品，用1 mL MSO溶解配成濃度為40 mg/mL原液，4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液將Gen溶液稀釋到所需要的濃度。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器

Milli-Q超純水系統(tǒng)為MILLIPORE產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為NuAire生產(chǎn)；電泳槽為BIO-RAD；CKX31型倒置顯微鏡為日本Olympus；IF-90紫外透射儀為上海顧林電光儀器廠生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（完全培養(yǎng)基）、空白對(duì)照組和Gen處理組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MGC-803細(xì)胞收集、離心并去除上清液，稀釋MGC-803細(xì)胞至5×104個(gè)/mL。按每孔200 μL將MGC-803細(xì)胞接種于3塊96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。然后棄除培養(yǎng)液，Gen處理組分別加入用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的不同濃度Gen溶液200 μL/孔（Gen濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）， 空白對(duì)照組則加RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL/孔，空白對(duì)照組和Gen處理組均設(shè)3個(gè)平行孔。在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，各組均在實(shí)驗(yàn)終止前4 h時(shí)加5 mg/mL濃度的MTT 20 μL/孔，并于4 h后棄除上清液，每孔再加DMSO 150 μL。以空白組（完全培養(yǎng)基）將酶標(biāo)儀調(diào)零，570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算Gen對(duì)GMC-803細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-Gen處理組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值）×100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.4.2 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和Gen處理組。上述兩組均培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液，Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各組均設(shè)平行孔3個(gè)。37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，光鏡下觀察經(jīng)Gen處理后MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

1.4.3 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，稀釋至5×104個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)皿，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組、40 μg/mL Gen處理組。空白對(duì)照組加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液，40 μg/mL Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各組均設(shè)平行孔3個(gè)，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。按試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行樣品提取、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白、分離磷酸化和非磷酸化的PepTag短肽、熒光光度計(jì)定量分析檢測(cè)PepTag結(jié)果及計(jì)算各組的PKA活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均服從正態(tài)分布。統(tǒng)計(jì)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)，進(jìn)一步的兩兩比較則分別采用SNK法和Dunnet-t檢驗(yàn)。兩組間采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gen對(duì)體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖有抑制作用，且抑制作用呈時(shí)間及濃度依賴(lài)性。用Gen處理24 h后，10 μg/mL Gen組、20 μg/mL Gen組、40 μg/mL Gen組與空白對(duì)照組比較，對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用顯著（P<0.01）；Gen處理48h后，5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用顯著（P<0.01）；而處理72 h后，所有Gen處理組均對(duì)MGC-803細(xì)胞有顯著抑制作用（P<0.01）。Gen處理48 h和72 h與24 h比較，Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組與空白對(duì)照組比較有抑制作用（P<0.05），而對(duì)于2.5 μg/mL組，僅處理72 h時(shí)有抑制作用（P<0.05）。Gen處理72 h與48 h相比較，Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在Gen濃度為40 μg/mL時(shí)，處理72 h后對(duì)MGC-803抑制率達(dá)72.3%，見(jiàn)表1。

2.2 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響

光鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼壁生長(zhǎng)旺盛。細(xì)胞外形輪廓清晰、細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密、大小均勻，呈現(xiàn)多邊形或梭形，且細(xì)胞質(zhì)的折光性較強(qiáng)。而經(jīng)過(guò)Gen處理后，發(fā)現(xiàn)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，細(xì)胞外形呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則狀、細(xì)胞間隙明顯增大，且細(xì)胞質(zhì)折光性較差，見(jiàn)圖1 。

2.3 Gen對(duì)MGC-803細(xì)胞PKA活性的調(diào)節(jié)

采用濃度為40 μg/mL的Gen處理MGC-803細(xì)胞，培養(yǎng)48h后檢測(cè)PKA活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組PKA活性為（0.571±0.053） U/mL，而Gen處理組PKA的活性為（0.97±0.09） U/mL，兩組間差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），如圖2。

3 討論

Gen是一種來(lái)源于大豆以及其他豆科植物中的大豆異黃酮，其具有雌激素、抗氧化、調(diào)血脂等功能。流行病學(xué)調(diào)查表明，在經(jīng)常食用豆制品的日本乳腺癌發(fā)病率僅為美國(guó)的1/4[4]，Gen可以降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴(lài)型腫瘤的發(fā)生率。有研究[3，5]亦發(fā)現(xiàn)，Gen可以抑制子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞（JEC）、人肝癌SMMC-7721、人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，然而Gen抗腫瘤作用分子機(jī)制尚不十分清楚[3]。本文研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比較，光鏡下經(jīng)Gen處理的MGC-803細(xì)胞折光性差，細(xì)胞間隙增大，提示Gen對(duì)體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用；而MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Gen可以顯著地抑制MGC-803細(xì)胞增殖，并隨著作用時(shí)間和濃度的增加而增強(qiáng)，呈時(shí)間及濃度依賴(lài)性。

cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)一系列的神經(jīng)遞質(zhì)、激素等胞外信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活此通路可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化[4-10]。PKA通過(guò)磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。如PKA可催化CREB（cAMP-responsive element binding Protein，CREB）、CREM（cAMP-responsive element binding modulator，CREM）及ATF1（activating transcription factor 1，ATF1）磷酸化，被激活的轉(zhuǎn)錄因子與CBP（CREB binding protein）和p300結(jié)合調(diào)控下游靶基因[8，11]。實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)Gen可以激活SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP-PKA信號(hào)通路，經(jīng)濃度為15μg/mL的Gen處理5min和10min后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高了11.0%和40.3%[9]。本文研究顯示，濃度為40μg/mL的Gen作用MGC-803細(xì)胞48h后，可以顯著提高M(jìn)GC-803細(xì)胞的PKA活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Gen亦可以不經(jīng)過(guò)第二信使cAMP而直接激活PKA，進(jìn)而抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞增殖。綜上所述，Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細(xì)胞系的增殖，上調(diào)PKA活性可能是Gen抑制MGC-803細(xì)胞增殖機(jī)制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Chen WF，Gao QG，Wong MS. Mechanism involved in genistein activation of insulin-like growth factor 1 receptor expression in human breast cancer cells[J]. Br J Nutr，2007，98（6）：1120-1125.

[2] Pavese JM，Krishna SN，Bergan RC. Genistein inhibits human prostate cancer cell detachment，invasion，and metastasis [J]. Am J Clin，2014，28；100（1）：431-436.

[3] Yan GR，Zou FY，Dang BL，et al. Genistein-induced mitotic arrest of gastric cancer cells by downregulating KIF20A：a proteomics study[J]. Proteomics，2012，12（14）：2391-2399.

[4] Zhao Q，Tao J，Zhu Q，et al. Rapid induction of cAMP/PKA pathway during retinoic acid-induced acute promyelocytic leukemia cell differentiation[J] Leukemia，2008，18（2）：285-292.

[5] Liu YL，Zhang GQ，Yang Y，et al.Genistein induces G2/M arrest in gastric cancer cells by increasing the tumor suppressor PTEN expression[J]. Nutr Cancer，2013，65（7）：1034-1041.

[6] Rahimi A，Lee YY，Abdella H，et al. Role of p53 in cAMP/PKA pathway mediated apoptosis [J]. Apoptosis，2013，18（12）：1492-1499.

[7] Zurita-Martinez SA，Cardenas ME. Tor and cyclic-AMP protein kinase A：two parallel pathways regulating expression of genes required for cell growth[J]. Eukaryot Cell，2005，4（1）：63-71.

[8] Thomson DM1，Herway ST，F(xiàn)illmore N，et al.AMP-activated protein kinase phosphorylates transcription factors of the？CREB？family [J]. J Appl Physiol，2008，104（2）：429-438.

[9] 林成招，馬海田，鄒思湘，等. 大豆異黃酮對(duì)大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)途徑的影響[J].生理學(xué)報(bào)， 2008；57（4）：517-522.

[10] Stratakis CA. cAMP/PKA signaling defects in tumors： genetics and tissue-specific pluripotential cell-derived lesions in human and mouse [J]. Mol Cell Endocrinol，2013，371（1-2）；208-220.

[11] Kim JM，Choi JS，Kim YH，et al. An activator of the cAMP/PKA/CREB pathway promotes osteogenesis from human mesenchymal stem cells [J]. J Cell Physiol，2013， 228（3）：617-626.

（收稿日期：2014-05-05）

[5] Liu YL，Zhang GQ，Yang Y，et al.Genistein induces G2/M arrest in gastric cancer cells by increasing the tumor suppressor PTEN expression[J]. Nutr Cancer，2013，65（7）：1034-1041.

[6] Rahimi A，Lee YY，Abdella H，et al. Role of p53 in cAMP/PKA pathway mediated apoptosis [J]. Apoptosis，2013，18（12）：1492-1499.

[7] Zurita-Martinez SA，Cardenas ME. Tor and cyclic-AMP protein kinase A：two parallel pathways regulating expression of genes required for cell growth[J]. Eukaryot Cell，2005，4（1）：63-71.

[8] Thomson DM1，Herway ST，F(xiàn)illmore N，et al.AMP-activated protein kinase phosphorylates transcription factors of the？CREB？family [J]. J Appl Physiol，2008，104（2）：429-438.

[9] 林成招，馬海田，鄒思湘，等. 大豆異黃酮對(duì)大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)途徑的影響[J].生理學(xué)報(bào)， 2008；57（4）：517-522.

[10] Stratakis CA. cAMP/PKA signaling defects in tumors： genetics and tissue-specific pluripotential cell-derived lesions in human and mouse [J]. Mol Cell Endocrinol，2013，371（1-2）；208-220.

[11] Kim JM，Choi JS，Kim YH，et al. An activator of the cAMP/PKA/CREB pathway promotes osteogenesis from human mesenchymal stem cells [J]. J Cell Physiol，2013， 228（3）：617-626.

（收稿日期：2014-05-05）

[5] Liu YL，Zhang GQ，Yang Y，et al.Genistein induces G2/M arrest in gastric cancer cells by increasing the tumor suppressor PTEN expression[J]. Nutr Cancer，2013，65（7）：1034-1041.

[6] Rahimi A，Lee YY，Abdella H，et al. Role of p53 in cAMP/PKA pathway mediated apoptosis [J]. Apoptosis，2013，18（12）：1492-1499.

[7] Zurita-Martinez SA，Cardenas ME. Tor and cyclic-AMP protein kinase A：two parallel pathways regulating expression of genes required for cell growth[J]. Eukaryot Cell，2005，4（1）：63-71.

[8] Thomson DM1，Herway ST，F(xiàn)illmore N，et al.AMP-activated protein kinase phosphorylates transcription factors of the？CREB？family [J]. J Appl Physiol，2008，104（2）：429-438.

[9] 林成招，馬海田，鄒思湘，等. 大豆異黃酮對(duì)大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)途徑的影響[J].生理學(xué)報(bào)， 2008；57（4）：517-522.

[10] Stratakis CA. cAMP/PKA signaling defects in tumors： genetics and tissue-specific pluripotential cell-derived lesions in human and mouse [J]. Mol Cell Endocrinol，2013，371（1-2）；208-220.

[11] Kim JM，Choi JS，Kim YH，et al. An activator of the cAMP/PKA/CREB pathway promotes osteogenesis from human mesenchymal stem cells [J]. J Cell Physiol，2013， 228（3）：617-626.

（收稿日期：2014-05-05）