鄧延莉，萬 謙，陸 華

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610037;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)生殖實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層的一類多功能干細(xì)胞，MSCs由于它的自我更新和多向分化潛能具有巨大的治療價(jià)值，并日益受到關(guān)注。其可在生化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞生長因子等條件下向各方向分化，成為如肌細(xì)胞［1］、成骨細(xì)胞［2］、神經(jīng)細(xì)胞［3］等各類細(xì)胞。國內(nèi)研究中越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，中藥有可能干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞向體外的分化［4-6］。

資沖顆粒是根據(jù)經(jīng)典方左、右歸丸而研制的一種補(bǔ)腎中藥復(fù)方。其由熟地、菟絲子等藥物組成，功效補(bǔ)腎化瘀、資沖調(diào)經(jīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)資沖顆粒能提高去勢雌小鼠的雌激素水平［7］及促進(jìn)大鼠的卵泡發(fā)育［8-9］。臨床上資沖顆粒常用于促卵泡發(fā)育及排卵，療效較好。但資沖顆粒是否有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞體外向生殖細(xì)胞方向分化的可能，目前尚未見報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)選用大鼠成體間充質(zhì)干細(xì)胞 (RMSC)為模型細(xì)胞，資沖顆粒大鼠含藥血清為檢測樣品，最終檢測資沖顆粒含藥血清干預(yù)后RMSC細(xì)胞形態(tài)、生殖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記基因和細(xì)胞增殖的變化情況，現(xiàn)報(bào)道如下:

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo公司，3111型);倒置顯微鏡 (Leica公司，DMI3000B型);酶標(biāo)儀 (Thermo公司，Multiskan spectrum);定量PCR儀 (Bio-Rad公司，CFX96)。

1.2 細(xì)胞、藥物與試劑 RMSC購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，資沖顆粒大鼠含藥血清由四川省中藥研究所提供;α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗(青霉素和鏈霉素)、磷酸緩沖液PBS(成都哈里公司);檢測試劑 MTT(美國 Sigma公司，M5655);RNA提取試劑盒 (美國 Molecular Research Center公司，TR 118);cDNA合成試劑盒(Fermentas公司，K1632);Sybr Green Qpcr試劑(Roche公司，04913850001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含藥血清及空白血清的制備 在體質(zhì)量均一的情況下隨機(jī)將20只大鼠分成2組:含藥血清組組、空白血清組，每組10只，雌雄各半。含藥血清組灌服資沖顆粒，給藥劑量均為5.0 g/kg，給藥容量均為20 mL/kg，空白組大鼠灌服蒸餾水。分別于給藥后30、60、90 min眼底靜脈叢取血，血液靜置2 h，3000 r/min離心10 min，分離各組各不同時(shí)間段血清，將每組3個(gè)時(shí)間段的血清混勻，高效液相色譜 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析血清，過濾除菌備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)RMSC，以3×105細(xì)胞/孔的量接種于6孔板中。24 h后分別加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%資沖顆粒大鼠含藥血清及空白大鼠血清進(jìn)行連續(xù)干預(yù)72 h，每天鏡下顯微觀察，在干預(yù)24 h后和72 h后進(jìn)行顯微采圖。

2.3 生殖細(xì)胞分化相關(guān)的標(biāo)記基因的檢測 如“2.1”項(xiàng)所述干預(yù)六孔板中的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，72 h后提取相關(guān)細(xì)胞孔的RNA，并以此RNA為模板立即合成cDNA，-80℃保存。利用Sybr Green Qpcr試劑進(jìn)行Qpcr實(shí)驗(yàn)，檢測與生殖細(xì)胞分化相關(guān)的 Oct4、Stra8、Itga6、Itgb1、Scp3、Gdf9、Zp1、Zp3等8種基因的表達(dá)量變化情況，選大鼠β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。針對上述基因的引物信息如表1。

表1 針對8種標(biāo)識基因及內(nèi)參基因的引物信息Tab.1 Primer information of eight marker genes and the reference gene

2.4 細(xì)胞增殖情況的檢測 將RMSC以2×103細(xì)胞/孔的量接種于96孔板中，共接種50孔。24 h后，將50孔細(xì)胞平均分成兩組 (25孔/組)，兩組分別加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%的資沖顆粒大鼠含藥血清和空白大鼠血清，連續(xù)干預(yù)5 d，每天對每個(gè)干預(yù)條件的5個(gè)細(xì)胞孔進(jìn)行MTT法檢測，連續(xù)測定5 d。

2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC形態(tài)學(xué)的影響 由圖1可見，終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%的資沖顆粒大鼠含藥血清干預(yù)RMSC過程中，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞集落多成放射狀或網(wǎng)狀，細(xì)胞逐漸融合，細(xì)胞之間界限不清;大鼠空白血清干預(yù)過程中，細(xì)胞形態(tài)類似于資沖顆粒大鼠含藥血清的干預(yù)情況;兩種血清干預(yù)之間的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化無明顯差異。

圖1 資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of the rat drug serum with Zichong Granules on the morphology of RMSC

2.6.2 資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC的多個(gè)生殖分化標(biāo)識基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 由表2可見，與大鼠空白血清比較，資沖顆粒大鼠含藥血清顯著影響了基因Stra8、Scp3和 Gdf9的轉(zhuǎn)錄表達(dá) (P=0.0359、0.0071、0.0227);而對其它基因的表達(dá)影響不顯著 (P＞0.05)。其中，基因Stra8被下調(diào)了56.13%，基因Scp3、Gdf9分別被上調(diào)了約3.6倍和9.5倍。

2.6.3 資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC細(xì)胞增殖的影響 通過Excel的回歸分析得到資沖顆粒大鼠含藥血清組及空白大鼠血清組的生長速率分別為0.1188和 0.1391(O.D.490 nm/d)。使用 SPSS 13.0軟件的協(xié)方差法對兩組生長速率進(jìn)行了精確的比較，結(jié)果表明兩組生長速率沒有顯著差異(P=0.1074)。由此可見，資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC的細(xì)胞增殖未有顯著影響。

表2 資沖顆粒大鼠含藥血清對RMSC的多個(gè)生殖分化標(biāo)識基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 (n=3)Tab.2 Effect of the rat drug serum with Zichong Granules on the transcriptional expression of several marker genes for reproduction differentiation(n=3)

3 討論

現(xiàn)代社會不孕不育的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，輔助生殖技術(shù)雖在治療不孕不育癥方面的得到了廣泛的應(yīng)用，但對生殖細(xì)胞缺乏而導(dǎo)致的不孕不育癥束手無策。近年來實(shí)驗(yàn)研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下有可能向生殖細(xì)胞分化［10-12］，但對于利用中藥干預(yù)細(xì)胞分化的報(bào)道較少，且未見資沖顆粒相關(guān)報(bào)道。

從細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖情況兩方面表明，資沖顆粒含藥血清與空白血清作用相似，在短時(shí)間內(nèi)尚未見其明顯毒性。

Qpcr結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含藥血清對 Gdf9、Stra8和Scp3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著影響。Gdf9及Stra8是雌、雄性生殖細(xì)胞分化方向的標(biāo)記基因［13-14］，在本實(shí)驗(yàn)中Gdf9被顯著上調(diào)而Stra8表達(dá)顯著下調(diào)。資沖顆粒中多含中藥熟地、菟絲子等滋陰填精之品，提示資沖顆粒含藥血清對女性生殖細(xì)胞的發(fā)育或在某些環(huán)節(jié)上有一定促進(jìn)作用，而對于Stra8基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制則需進(jìn)一步深入研究。Scp3為減數(shù)分裂的標(biāo)記基因［15］，間充質(zhì)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞方向分化需Scp3表達(dá)上調(diào)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含藥血清干預(yù)后的RMSC極有可能啟動了細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程使其向生殖細(xì)胞方向分化。

Oct4蛋白質(zhì)在維持未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新中起關(guān)鍵作用［16］，常被用做未分化細(xì)胞的標(biāo)記，本研究中發(fā)現(xiàn)資沖顆粒并未顯著影響Oct4的表達(dá)，說明資沖顆粒的促分化作用可能并未通過Oct4。Itga6基因和Itgb1基因分別編碼整合素α6和整合素β1，而整合素α6和整合素β1是精原干細(xì)胞的標(biāo)記物［17-18］，本研究發(fā)現(xiàn)這兩種基因的表達(dá)未受影響，進(jìn)一步說明資沖顆粒大鼠含藥血清并未誘導(dǎo)細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化。Zp1和Zp3是雌性分化后期的標(biāo)識基因［19］，本研究發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)均未受影響，說明向雌性生殖細(xì)胞的分化可能還處于初期階段。

綜上所述，資沖顆粒有可能誘導(dǎo)RMSC向雌性生殖細(xì)胞方向分化。實(shí)驗(yàn)補(bǔ)腎中藥資沖顆粒臨床上促女性卵泡發(fā)育的部分原因可能在于誘導(dǎo)了干細(xì)胞向新的雌性生殖細(xì)胞分化。

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