楊 浩，謝欣梅，龐曉斌*

(1.河南大學(xué)藥物研究所，河南開封 475004;2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475004)

糖尿病是近年來發(fā)病率逐年攀升的代謝性疾病，高血糖為其主要臨床特征，胰島素絕對或相對缺乏是其基本病理生理改變，因此，降低血糖和改善胰島素抵抗是防治糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。目前臨床應(yīng)用的降糖藥主要有磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、腸肽類激素 (GLP-1)類似物、胰島素及其類似物等。這些藥物各有局限性，尤其化學(xué)類降糖藥存在副作用大等不良反應(yīng)［1－2］。中醫(yī)藥在糖尿病治療中以其副作用小、效果顯著等特點顯示了極大的優(yōu)勢。

覆盆子酮是中藥覆盆子Rubus chingii Hu果實中的主要成分之一［3］，有研究表明，覆盆子果實富含鞣花酸、超氧化物、糖、黃酮、花青素、多酚類、SOD酶等［4］，現(xiàn)代藥理實驗證明，覆盆子具有抗衰老、抗氧化、防止心血管疾病、降血糖、降血脂等作用，但有關(guān)覆盆子酮的降糖作用機(jī)制研究較少［5］。本研究以人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞為研究對象，觀察覆盆子酮對其糖消耗的影響，探討覆盆子酮的降糖作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 實驗材料與主要儀器

1.1 實驗材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物篩選中心實驗室保存。

藥物及試劑 覆盆子酮 (Raspberry ketone)(浙江新化化工股份有限公司生產(chǎn)，批號為09120012);DMEM培養(yǎng)基 (Gibico公司);胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶 (美國Hyclone公司);血糖測試盒 (氧化酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司);噻唑藍(lán) (MTT)、羅格列酮、牛胰島素(美國Sigma公司);Trizol、RT-PCR試劑盒 (北京全式金生物技術(shù)有限公司);SHP-1、β-actin基因引物 (南京金維智生物技術(shù)有限公司合成);兔多克隆抗體IRS-1、β-actin，熒光標(biāo)記二抗兔抗IgG(美國Cell Signal公司);BCA法蛋白濃度測定試劑盒 (北京平原皓生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器 超凈工作臺 (SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (3432Thermo Fisher Scientific);倒置顯微鏡 (ECLIPSE TS100-F NIKON);酶標(biāo)儀 (SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH);凝膠成像系統(tǒng) (JYO4S-3B北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳代。

2.2 MTT法測定HepG2細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為8×103cells/well，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，用于實驗。棄上清，加入完全培養(yǎng)基配制的不同濃度覆盆子酮，使其終濃度分別為 1 ×10－6、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3、1 ×10－2、1 ×10－1mol/L。并設(shè)空白調(diào)零孔(只加DMEM培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)。每組均設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度 (OD)值，吸光值的高低與細(xì)胞活力成正相關(guān)性。

2.3 葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞葡萄糖消耗量 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以8×103cells/well接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁12 h后，細(xì)胞融合度70%，用于葡萄糖消耗實驗。

實驗分為空白組、對照組、覆盆子酮組、羅格列酮陽性對照組 (3×10－5mol/L)?？瞻捉M:無細(xì)胞，只加入等量培養(yǎng)基;對照組:有細(xì)胞，不加藥，只加入等量培養(yǎng)基;覆盆子酮的終濃度分別為1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6、1 ×10－5、1×10－4、1×10－3mol/L。每組設(shè) 3個復(fù)孔。加藥24 h以葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖量。

葡萄糖消耗量 (mmol/L)=預(yù)定時間點空白組孔殘余在培養(yǎng)基中的平均葡萄糖量－預(yù)定時間點各實驗組殘余在培養(yǎng)基中的葡萄糖量。

2.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞SHP-1 mRNA基因的表達(dá) 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以8×104cells/well接種在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的覆盆子酮，使其終濃度分別為10－6、10－5、10－4mol/L，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。利用 RTPCR試劑盒擴(kuò)增 SHP-1基因。SHP-1-正向引物:5'-CCTGGAGACTTCGTGCTTT-3'，SHP-1-反向引物:5'-GGCGATGTAGGTCTTAGCG-3'。產(chǎn)物長度為546 bp。β-actin為內(nèi)參，正向引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物長度為186 bp。

擴(kuò)增條件 β-actin基因:94℃ 5 min，94℃30 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個循環(huán)。SHP-1基因:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳并通過凝膠成像系統(tǒng)檢測SHP-1與β-actin基因表達(dá)量。

2.5 Western Blot檢測IRS-1蛋白的表達(dá) 收集相應(yīng)處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白。配置10%分離膠和濃縮膠，取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入IRS-1(1∶1000)一抗4℃孵育過夜，TBST洗5次，二抗 (1∶2000)孵育2 h，TBST洗5次，通過 ECL試劑盒進(jìn)行顯影檢測。

3 實驗結(jié)果

3.1 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞活力的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，各劑量的覆盆子酮對HepG2細(xì)胞的活力無明顯影響 (P＞0.05)。見圖1。

圖1 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞活力的影響 (n=3，)Fig.1 Effect of raspberry ketone on cell viability of HepG2 cells(n=3，)

3.2 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響實驗結(jié)果表明，1×10－8～1×10－3mol/L濃度的覆盆子酮作用細(xì)胞24 h后，均可促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，其中1×10－6～1×10－3mol/L劑量組差異顯著 (P＜0.05)。與對照組相比，1×10－6～1×10－3mol/L劑量組葡萄糖消耗量增加率可達(dá)22.41% ～44.63%，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，接近于羅格列酮組(47.96%)。見圖2。

圖2 覆盆子酮對HepG2葡萄糖消耗的影響 (n=3，)Fig.2 Effect of raspberry ketone on glucose consumption in HepG2 cells(n=3，)

3.3 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA基因表達(dá)的影響 由圖3可知:PCR擴(kuò)增條帶位置正確:β-actin(186 bp)，SHP-1(546 bp)。與對照組相比，經(jīng)覆盆子酮作用后，隨覆盆子酮濃度的增加，HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA基因表達(dá)呈劑量依賴性的明顯降低 (P＜0.01)。見圖3。

3.4 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)覆盆子酮作用后，HepG2細(xì)胞 IRS-1蛋白表達(dá)量明顯提高(P＜0.01)。并且不同濃度的覆盆子酮呈劑量依賴性的增加IRS-1蛋白表達(dá)量。見圖4。

圖3 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞SHP-1 mRNA表達(dá)的影響 (n=3，)Fig.3 Effect of raspberry ketone on mRNA expression of SHP-1 in HepG2 cells(n=3，)

圖4 覆盆子酮對HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)的影響(n=3，)Fig.4 Effect of raspberry ketone on expression of IRS-1 in HepG2 cells(n=3，)

4 討論

糖尿病是目前僅次于腫瘤和心腦血管病的嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，以高血糖為其主要臨床特征，臨床常用降糖藥物，治療效果各有局限性，尋找治療糖尿病的新藥已成為防治糖尿病的研究熱點。覆盆子酮是中藥覆盆子果實中的主要成分之一。有研究表明，覆盆子具有降血糖、降血脂等作用［5-6］，本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，探討覆盆子酮的體外降糖作用及其相關(guān)機(jī)制。實驗結(jié)果表明，降糖寧對細(xì)胞活力無明顯影響，說明覆盆子酮對人肝癌HepG2細(xì)胞無明顯毒性。

葡萄糖消耗實驗是體外實驗中評價藥物是否具有降糖作用的常用方法之一，常用的細(xì)胞系有HepG2人肝癌細(xì)胞、3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞、L6大鼠骨骼肌細(xì)胞［7-8］。本實驗選用HepG2人肝癌細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖消耗實驗，評價了覆盆子酮對細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。實驗結(jié)果顯示覆盆子酮具有良好的降糖作用，可明顯促進(jìn)HepG2葡萄糖消耗，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，降糖效果接近于羅格列酮組 (47.96%)。

胰島素受體底物 (IRS-1)與胰島素受體(IR)結(jié)合后被磷酸化，參與胰島素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游蛋白［9-11］。磷酸化的IRS-1通過激活PI3K/AKT通路，進(jìn)而增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(glucose transporter 4，GLUT4)的膜轉(zhuǎn)位及轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能力，促進(jìn)組織、細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用［12-14］。本研究結(jié)果表明1×10－6～1×10－4mol/L濃度范圍內(nèi)的覆盆子酮均能增加HepG2細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)量，并且呈劑量依賴性關(guān)系，提示覆盆子酮可以促進(jìn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物的表達(dá)，進(jìn)而起到降糖作用。

SHP1是體內(nèi)廣泛表達(dá)的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTP)，SHP1和磷酸化的IR和IRS-1結(jié)合在一起參與胰島素信號通路的調(diào)節(jié)［15-16］。SHP1通過與胰島素受體結(jié)合并使之去磷酸化，減弱胰島素的活化，進(jìn)而抑制IRS-PI3K-Akt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］。SHP1缺失，導(dǎo)致胰島素引發(fā)的IR、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化水平升高，以及PI3K和Akt的活化［18-19］。因而，通過抑制SHP1在體內(nèi)的活性，有可能恢復(fù)糖尿病病人對血糖的控制能力。本實驗結(jié)果表明1×10－6～1×10－4mol/L的覆盆子酮呈劑量依賴性地下調(diào)SHP-1 mRNA基因表達(dá)量。此結(jié)果提示覆盆子酮可能通過抑制HepG2細(xì)胞中SHP-1的表達(dá)量，增強(qiáng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化水平，從而發(fā)揮其降糖作用。

綜上所述，覆盆子酮可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗。覆盆子酮的降糖作用機(jī)制可能與影響胰島素信號通路中IRS-1和SHP-1的表達(dá)有關(guān)。覆盆子酮對胰島素信號通路中其他靶點的調(diào)節(jié)作用還需進(jìn)一步深入研究。

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