張 鍇，陳思思，鄔 琳，徐 佳，陳超群，陳小慧，楊 群，*

(1.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江紹興 312000;2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江紹興 312000;3.杭州集和醫(yī)藥咨詢有限公司，浙江杭州 310023)

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉［1］?！吨袊幍洹?010年版一部收載了山楂葉提取物，其主要成分為總黃酮。

現(xiàn)代研究表明，山楂葉總黃酮具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血脂、降血壓、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、保護(hù)心肌、降血糖、抗血小板凝聚、促進(jìn)消化［2-14］等方面的作用。用于治療氣結(jié)血瘀、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴、冠心病、心絞痛、高脂血、腦動(dòng)脈供血不足等癥。目前已有其中成藥制劑(益心酮系列產(chǎn)品)上市，包括片劑、膠囊、滴丸。其中益心酮片已收載于《中國藥典》2010年版，需每次服2～3片 (32 mg/片)，日服3次，由于心腦血管疾病治療往往需要長期用藥，為減少服藥次數(shù)，提高病人的順應(yīng)性，降低普通制劑血藥濃度波動(dòng)，提高治療效果，本試驗(yàn)擬設(shè)計(jì)一種日服1～2次生物溶蝕性骨架型緩釋片，并對緩釋片的釋放機(jī)制進(jìn)行考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 11292型單沖壓片機(jī) (上海天凡藥機(jī)制造廠);ZRC-8ST型智能溶出度測定儀 (天津創(chuàng)新電子設(shè)備制造有限公司);UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì) (尤尼柯 (上海)儀器有限公司);BSA223S型電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等。

1.2 試藥 山楂葉總黃酮 (藥用，太極集團(tuán)浙江東方制藥公司，含量90%);蘆丁對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-20040);硬脂酸鎂、微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉、羥丙甲纖維素(藥用，安徽山河藥用輔料有限公司);乳糖 (藥用，鎮(zhèn)江康富生物工程有限公司);硬酯醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 建立分析方法

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得 (每1 mL中含無水蘆丁0.20 mg)。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約75 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲30 min，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 確定檢測波長 精密量取對照品溶液5 mL置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外—可見分光光度法 (藥典附錄VA)，在450～550 nm波長范圍內(nèi)掃描，測定吸光度，確定最大吸收波長。結(jié)果:山楂葉總黃酮在508 nm處有最大吸收，故選擇508 nm為山楂葉總黃酮的測定波長。

2.1.4 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液l mL，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外一可見分光光度法 (附錄VA)，在508 nm波長處測定吸光度，以吸光度 (A)對濃度 (C)進(jìn)行回歸，得回歸方程:A=11.549C +0.0418，r=0.99995(n=6)，線性范圍為0.008～0.048 mg/mL。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取蘆丁對照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，照“2.1.4”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起，放置0、1、2、4、8和24 h，依法測定吸光度，計(jì)算吸光度的RSD。計(jì)算得吸光度的RSD為0.37%(n=6)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，照“2.1.4”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度6次，計(jì)算平均吸光度和RSD。計(jì)算得平均吸光度為0.504，RSD為0.29%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份，各20片，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液。精密量取 5 mL，置 25 mL量瓶中，照“2.1.4”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度，計(jì)算供試品溶液總黃酮的平均含量和RSD(n=6)。計(jì)算得總黃酮平均含量為0.519 g/g，RSD為0.55%(n=6)，表明重現(xiàn)性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取1.5 mg蘆丁對照品6份，分別加入處方量輔料，置100 mL量瓶中，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品，照“2.1.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算平均回收率和RSD。結(jié)果，平均回收率為100.57%，RSD為0.18%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于山楂葉總黃酮生物溶蝕性骨架型緩釋片中總黃酮的含量測定。

2.2 山楂葉總黃酮緩釋片的處方優(yōu)化 以硬脂醇為生物溶蝕性骨架材料，再輔以其他輔料如填充劑預(yù)膠化淀粉、乳糖，黏合劑羥丙基甲基纖維素(HPMC K10)，潤滑劑硬脂酸鎂制作緩釋片。處方見表1。

表1 處方Tab.1 Formulation

2.3 緩釋片制備 按上述處方稱取硬脂醇，放入蒸發(fā)皿中于80℃水浴加熱至熔融，備用;取處方量的山楂葉總黃酮，加入硬脂醇中混合均勻后，從水浴中取下，放冷至室溫;取乳糖、預(yù)膠化淀粉置研缽中研細(xì)，過80目篩，加入上述混合物中，混合均勻;向上述混合物中加入適量羥丙甲纖維素膠漿 (以80%乙醇適量溶解)混合制軟材，至軟材握之成團(tuán)，輕壓即散，擠壓過16目篩制濕顆粒;將濕顆粒放入干燥箱中，40～50℃干燥30～45 min;取出過16目篩整粒，加硬脂酸鎂，總混;用直徑10 mm的淺沖壓片，控制片劑硬度5.0～6.0 kg、片重300 mg。

2.4 片劑釋放度的測定 取制得緩釋片6片，分別精密稱重，照釋放度測定法(《中國藥典》2010版二部附錄XD第一法)，用溶出度測定法 (2010版《中國藥典》二部附錄X C第二法)的裝置，以水900 mL為釋放介質(zhì)，溫度為 (37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，依法操作，經(jīng)1、2、3、4、5、6、8、10和 12 h時(shí)，分別取溶液 5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，并即時(shí)補(bǔ)充相同溫度、相同體積的釋放介質(zhì)，分別精密量取續(xù)濾液3 mL，置25 mL量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的含量，計(jì)算累積釋放百分率。見表2。

表2 累積釋放百分率 (%)Tab.2 Cumulative release percentage(%)

結(jié)果:釋藥速率隨硬酯醇、羥丙甲纖維素用量增加而減慢，隨乳糖、預(yù)膠化淀粉用量增加而加快，因?yàn)橛蝉ゴ加昧吭酱?，溶蝕越慢，羥丙甲纖維素用量增加，片劑黏結(jié)力增強(qiáng)，溶蝕越慢，乳糖、預(yù)膠化淀粉用量增加，釋藥加快。1～6號(hào)處方釋藥較慢，在12 h內(nèi)釋藥不夠完全，7號(hào)處方釋藥緩慢而持久，累積釋放百分率2 h為23.3%，5 h為55.2%，8 h為78.4%，12 h為92.2%，在12 h內(nèi)呈現(xiàn)良好的緩釋特征。見圖2。確定的最佳處方組成為:山楂葉總黃酮100.0 g，硬脂醇26.0 g，羥丙甲纖維素10.0 g，乳糖60.0 g，預(yù)膠化淀粉60.0 g，硬脂酸鎂4.0 g，制成866片。

圖1 釋放度曲線Fig.1 Release curves

2.5 擬合釋放動(dòng)力學(xué)方程 將緩釋片的體外釋放數(shù)據(jù)分別按零級(jí)、一級(jí)、Higuchi和Ritger-Peppas釋藥動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合。見表3。

表3 緩釋片體外釋藥動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果Tab.3 Fitting results of sustained-release tablets in vitro release kinetics model

結(jié)果:采用的各種模型中，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型優(yōu)于其他模型。對于片狀骨架型制劑來講，Ritger-Peppas方程中釋放指數(shù)在0.5～1.0之間時(shí)，藥物釋放機(jī)制為擴(kuò)散和溶蝕綜合作用的結(jié)果。由表1可知本實(shí)驗(yàn)的釋放指數(shù)n值為0.9862，由此可推斷山楂葉總黃酮生物溶蝕性骨架型緩釋片屬于擴(kuò)散和溶蝕雙重釋藥機(jī)制。

2.6 山楂葉總黃酮生物溶蝕性骨架型緩釋片的含量測定 取緩釋片20片，精密稱定，研細(xì)，取適量，精密稱定，照“2.1.1”項(xiàng)供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，制備供試品溶液。精密量取5 mL置25 mL量瓶中，照“2.1.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中蘆丁的含量，計(jì)算緩釋片的總黃酮的含量。結(jié)果:本品每片含總黃酮以無水蘆丁計(jì)(C27H30O16)為103.1 mg。

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病為當(dāng)今人類死亡率最高的三大主要疾病之一，山楂葉總黃酮制劑在臨床上廣泛用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療，主要?jiǎng)┬陀衅胀ㄆ瑒?，膠囊、滴丸。這些普通制劑必須通過一日多次給藥才能達(dá)到藥物治療濃度，同時(shí)藥物進(jìn)入血液循環(huán)后血藥濃度波動(dòng)很大。在心血管系統(tǒng)疾病治療中，由于藥物治療窗較窄，使用普通制劑之后血藥濃度很快就會(huì)達(dá)到峰值，易產(chǎn)生毒副作用，之后血藥濃度會(huì)快速下降，達(dá)到谷值，低于有效濃度，從而不能起到治療作用，而藥物緩釋制劑克服了這一缺點(diǎn)。將山楂葉總黃酮制成生物溶蝕性骨架型緩釋片，減少服藥次數(shù)，大大提高了病人的順應(yīng)性;血藥濃度平穩(wěn)，有利于降低藥物的毒副作用，提高治療效果;允許病人作為門診病人接受藥物治療，降低治療費(fèi)用。

本試驗(yàn)以硬脂醇為生物溶蝕型骨架材料，再以填充劑預(yù)膠化淀粉、乳糖等調(diào)節(jié)藥物釋放速度，以釋放度為指標(biāo)優(yōu)化處方。確定的最佳處方組成為:山楂葉總黃酮100.0 g，硬脂醇26.0 g，羥丙甲纖維素10.0 g，乳糖60.0 g，硬脂酸鎂4.0 g，預(yù)膠化淀粉60.0 g。體外釋放度試驗(yàn)表明，其具有高效、長效的特點(diǎn)，可延緩藥物的釋放。分別采用零級(jí)釋放、一級(jí)釋放、Higuchi模型對體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，山楂葉總黃酮生物溶蝕骨架型緩釋片釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，制得的緩釋片在12 h內(nèi)呈現(xiàn)良好的緩釋特征。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:30.

［2］史逸達(dá).山楂葉總黃酮藥理作用淺析［J］.中國中醫(yī)藥咨訊，2012，4(1):437.

［3］鞠曉蕓，方泰惠，張文通.山楂葉總黃酮凍干粉對麻醉犬冠脈結(jié)扎所致心肌梗死的影響［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(6):381-383.

［4］楊宇杰.山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血管功能損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2007，38(11):1687.

［5］葉希韻，王耀發(fā).山楂葉總黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2002，19(4):267-268.

［6］Roddewing C，Hensel H.Reaction of local myocardial blood flow in nonanes the tized dogs and an esthetized cats tooraland parenteral application of a Crataegus fraction(oligo meric procyanidin)［J］.Arzneim Forsch，1977，27(7):1407-1410.

［7］喻 斌，李宏軼，張 良，等.山楂葉總黃酮對麻醉犬冠脈結(jié)扎所致心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19(6):461-464.

［8］李 莉，呂 紅，龐 紅.山楂葉總黃酮抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(9):2143.

［9］陳 雄.山楂葉總黃酮對大鼠腎缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.實(shí)用兒科雜志，2007，22(5):359-360.

［10］陳芝蕓，嚴(yán)茂祥，何蓓暉.大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)形成中氧化應(yīng)激水平變化及山楂葉總黃酮對其影響［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(12):33-36.

［11］Delporte M L，F(xiàn)unahashi T，Takahashi M，et al.Pre-and posttranslation al negaive effect of 13-adrenoceptor agonistson adiponectin secretion:in vitro and in vivo studie［J］.Biochem J，2002，367:677-685.

［12］紀(jì)影實(shí)，李 紅，楊世杰.山楂葉總黃酮對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào).2006，2006，22(6):760.

［13］葉希韻，張 隆，沈 菊，等.山楂葉總黃酮對糖尿病小鼠糖脂代謝的影響［J］.中草藥，2005，36(11):1683-1687.

［14］焦利萍.山楂葉總黃酮對急性血淤模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響［J］.中國醫(yī)藥與臨床，2008，8(1):49-50.