章運典，周里欣，陳洪英

(河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽 474500)

天智顆粒用于治療血管性癡呆的純中藥制劑。主要由天麻、鉤藤、槐花、梔子、黃芩、石決明、桑寄生、首烏藤等組成。具有平肝潛陽、補(bǔ)益肝腎、益智安神的功效。用于肝陽上亢中風(fēng)引起的智能減退、記憶力差、思維遲緩、定向力差、計算力差、理解多誤、伴頭暈?zāi)垦?、頭痛、煩燥易怒、失眠、口苦咽干、腰膝酸軟等輕中度血管性癡呆的證候［1-3］?，F(xiàn)執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只測定了天麻素的量，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法同時測定了方中天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷4種成分的量，所建立的方法簡便，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，為本制劑提供了較全面的定量分析方法。能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站，VWD檢測器，二元梯度泵，自動進(jìn)樣器，UP超純水機(jī);BP211D Satorius十萬分之一電子天平;HANGPING FA2104V電子天平;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 對照品 天麻素 (批號110807-200205)，梔子苷 (批號110749-201115，純度99.7%)、蘆丁(批號110080-200707，純度90.5%)、黃芩苷 (批號110857-201016，純度94.0%)，上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。

1.4 樣品 天智顆粒由河南省宛西制藥股份有限公司生產(chǎn) (批號分別為 20130901，20130902，20130903)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm 5 μm);流動相為乙腈 (A)-0.05%磷酸 (B)，梯度洗脫 (0～7 min，2%A;7～15 min，2% ～15%A;15～30 min，15% ～30%A);體積流量1.0 mL/min;檢測波長220 nm。理論板數(shù)按天麻素峰計算，應(yīng)不低于2000。在此條件下，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷峰與其他組分能達(dá)到較好分離 (見圖1)。

圖1 天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gastordine，geniposide，rutin and baicalin contents in Tianzhi Granules

2.2 對照品溶液的制備 分別取經(jīng)五氧化二磷干燥的天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷分別為0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg的混合溶液，即得對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別制備不含天麻、梔子、槐花、黃芩的陰性樣品，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)專屬性試驗 分別吸取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果樣品與對照品色譜圖相同保留時間處有色譜峰，陰性樣品在與對照品色譜圖相同的保留時間處無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對以上4種成分的測定無干擾 (見圖1)。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)，進(jìn)樣量 (X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得線性方程，各對照品質(zhì)量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation

2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計算RSD值。天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的峰面積RSD分別為0.9%、0.7%、0.6%、0.9%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，計算，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的RSD分別為1.3%、1.6%、1.5%和1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 (批號20130901)，按“2.3”項下方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算，天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷的RSD值分別為1.2%、1.1%、1.4%和1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取已知含有量 (天麻素2.3 mg/g、梔子苷7.2 mg/g、蘆丁7.5 mg/g、黃芩苷10.4 mg/g)的樣品 (批號20130901)約0.2 g，共6份，精密稱定，分別精密加入50%甲醇配制的混合對照品溶液10 mL(含天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷分別為 0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg/mL)，再精密加入50%甲醇40 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下方法進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.11 樣品測定 取3批樣品 (批號130901、130902、130903)，每批3份，按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件對3批樣品 (進(jìn)樣量10 μL)進(jìn)行測定，記錄峰面積，外標(biāo)法計算，數(shù)據(jù)以表示，測得結(jié)果見表3。

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測波長的選擇［4-10］天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷分別在220、240、257、280 nm處有最大吸收。220 nm下天麻素、梔子苷、蘆丁、黃芩苷均有較強(qiáng)的吸收，可以同時檢測4種成分，而天麻素在其他波長條件下無吸收，故選擇220 nm作為檢測波長。既可以滿足檢測的需要，又簡化實驗方案。

表3 樣品測定結(jié)果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

表3 樣品測定結(jié)果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

批號 天麻素/(mg·g －1)梔子苷/(mg·g －1)蘆丁/(mg·g －1)黃芩苷/(mg·g －1)1309012.307±0.0257.200±0.0217.497±0.05110.420±0.0361309022.220±0.0367.270±0.0567.690±0.03610.197±0.0611309032.917±0.0327.510±0.0997.930±0.04611.517±0.065

3.2 提取溶劑、提取方法及提取時間的選擇［8-13］實驗中比較了回流提取和超聲提取兩種方法制備供試品溶液，結(jié)果測得成分的量無明顯差異，由于超聲提取法具有效率高、操作簡便等優(yōu)點，所以采取超聲提取法;實驗中考察了甲醇、稀乙醇、50%甲醇、水等為提取溶劑，結(jié)果50%甲醇提取效果較好;考察了超聲提取時間20、30、40、60 min，結(jié)果超聲提取30、40、60 min，提取效率相當(dāng)，故確定以50%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min。

3.3 流動相的選擇［8-13］實驗中采用梯度洗脫，曾用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等作為流動相，并調(diào)節(jié)流動相的比例，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相，分離效果好，峰形好，基線較穩(wěn)定。

3.4 小結(jié) 天智顆?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［1］中，采用高效液相色譜法，只測定了天麻素的量，而且所用的流動相也單一。中藥復(fù)方制劑均由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)同時發(fā)揮而達(dá)到治療效果，故對于單味藥的檢測是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，難以控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，所以為了更好地控制本產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究采用RP-HPLC法同時測定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷的量，方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為提升天智顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)，可用于天智顆粒的質(zhì)量控制。

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