常宏，呂明，喬春霞，李新穎，耿晶，周婷婷，林周，沈倍奮，馮健男

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基于TNF功能表位設計新型人源單鏈抗體

常宏，呂明，喬春霞，李新穎，耿晶，周婷婷，林周，沈倍奮，馮健男

100850 北京，軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所（常宏、呂明、喬春霞、李新穎、耿晶、周婷婷、林周、沈倍奮、馮健男）；050200 石家莊，河北中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院（常宏）

開發(fā)基于 TNF 功能表位的新型人源單鏈抗體。

利用自主研制的鼠抗 TNF-α 中和單抗 Z12 能特異性識別 TNF-α 的 141 ~ 146 位功能表位特性，通過理論模擬構建 TNF/抗體 Z12 相互作用的復合物模型設計獲得功能性拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及單域抗體 PTVH5（以人抗體可變區(qū)重鏈框架 VH5 為支架合理展示 PT2、PT3、PT4），利用計算機輔助分子設計以及同源模建、分子對接方法，進一步合理選擇人抗體可變區(qū)輕鏈框架（Vκ1）作為展示支架，通過構象判別、作用能比較以及識別區(qū)域確認并選擇合適的連接肽設計新型單鏈分子ScFv_AB1。

理論分析發(fā)現(xiàn)，ScFv_AB1 穩(wěn)定性較好，識別 TNF-α 的 141 ~ 146 功能位點（即 Z12 識別的位點）。生物學實驗證明，ScFv_AB1 能與 TNF-α 結合、抑制 TNF-α 與 TNFR 的結合、抑制TNF-α 介導的細胞毒作用。

初步驗證了“借助計算機模建，基于人抗體可變區(qū)的框架結構和拮抗肽設計單鏈抗體分子”的策略是可行的，從而為人源小分子抗體的制備提供了一條可供選擇的途徑。

腫瘤壞死因子α； 單鏈抗體； 計算機輔助設計； 支架； 同源模建； 拮抗肽

腫瘤壞死因子 α（TNF-α）是一種多功能的細胞因子，主要由激活的單核細胞/巨噬細胞、T 淋巴細胞分泌，其他如中性粒細胞、肥大細胞及內皮細胞在一定條件下也能產(chǎn)生[1-3]。成熟的 TNF-α（17 kD）由膜型 TNF-α（26 kD）切割而產(chǎn)生，兩種形式的 TNF-α 都具有生物活性[4]。TNF-α 有3 個與受體結合的主要活性表位，即 29 ~ 36、84 ~ 91 和 141 ~ 146 位。TNF-α 以活性三聚體的形式與細胞表面的 TNF-α 受體（TNFR）結合，從而啟動信號通路，發(fā)揮生物學功能[5-8]。

TNF-α 的過表達與類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的密切關系已得到證實[9-11]。TNF-α 還是一個重要的前炎性細胞因子，可以介導多種炎性因子的釋放，如 IL-1、IL-6、GM-CSF[12]。越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與 TNF-α 的過量分泌有關，TNF-α 已經(jīng)成為治療這類疾病的一個有效靶標[13-15]。

目前，已被 FDA 批準的 TNF-α 拮抗劑有：依那西普（商品名：恩利）是 TNFRII-Fc 融合蛋白；Remicade（infliximab）是一種人-鼠嵌合單抗；Humira（adalimumab）是利用抗體庫技術篩選得到的人源單抗，它們主要用于 RA 和結腸克羅恩病的治療[15-16]。

課題組在 TNF-α 中和抗體制備、TNF-α 拮抗分子設計方面已取得了一定進展：確定了具有自主知識產(chǎn)權的鼠源中和抗體 Z12 識別的 TNF-α 的功能表位（141 ~ 146 位氨基酸殘基）[17]；根據(jù)TNF/抗體相互作用的立體結構信息，設計了一系列具有中和活性的拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）[18-19]；為提高拮抗肽的穩(wěn)定性和活性，將拮抗肽 PT4 與人 IgG1 的 Fc 段連接構建 PT4-Fc 融合蛋白[20]；嘗試利用人抗體可變區(qū)的重鏈 VH5 框架來展示 TNF-α 拮抗肽（PT2、PT3、PT4），設計得到人源單域抗體 PTVH5[21]。結果顯示，與單獨的拮抗肽相比，新構建的 PT4-Fc 或 PTVH5 的穩(wěn)定性增強，生物學活性明顯提高，而且抗體可變區(qū)框架比 Fc 段更適于展示拮抗肽。

抗體可變區(qū)框架的應用價值已被抗體庫的蓬勃發(fā)展充分證實[22-24]，盡管所設計的拮抗分子的活性還不能令人滿意，但已證明這是一條比較合理的設計拮抗分子的途徑，它促使我們進一步去開發(fā)活性更好的拮抗分子。

分析認為，在單域抗體 PTVH5 的基礎上設計單鏈抗體，可能會獲得活性更好的拮抗分子。理論上講，隨著 VL的加入，其 LCDR3 與 HCDR3 能形成較強的疏水口袋，通過“鎖-鑰匙”結構與抗原表位緊密結合，加上其他重、輕鏈 CDR 區(qū)的作用，有利于抗原-抗體復合物的形成，也更符合天然抗體識別抗原的模式；同時，與單域抗體相比，單鏈抗體的半衰期將大大延長?；诖?，本論文依據(jù)已有的拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及人抗體可變區(qū)基因聚類分析結果（七類 VH，七類 VL），嘗試利用人抗體重、輕鏈可變區(qū)框架合理展示拮抗肽，設計人源單鏈抗體構象庫；借助 TNF/抗體相互作用的立體結構信息，合理設計、篩選新型 TNF 拮抗分子。

1 材料與方法

1.1 材料

計算機模建所用硬件為美國 Silicon Graphics Inc.（SGI）圖形工作站、IBM 工作站。軟件為Insight II（2005）程序包。

pET22b(+) 質粒、表達菌株 BL21（DE3，基因型為 F-ompT hsdSB r-m-gal dcm）由本研究室保存；限制性內切酶購自美國 NEB 公司；T4 DNA 連接酶購自美國 Gibco 公司；高保真 Taq 酶（pyrobest）購自日本 Takara 公司；螯合 Ni2+的瓊脂糖凝膠層析柱購自北京本元正陽基因技術有限公司；Anti-His 抗體購自美國Invitrogen 公司；HRP 標記的羊抗鼠 IgG 由本室制備保存；人可溶性 TNFRI 及 TNFRII 購自美國 R & D systems 公司；熒光檢測試劑盒購自美國Promega 公司；TNF 抗原由本研究室表達、純化獲得，英夫利昔單抗（商品名：Remicade）購自美國強生公司。

1.2 方法

1.2.1 同源模建 根據(jù) Knappik 的聚類分析結果[22]，利用 Homology 模塊對構建的人抗體輕鏈可變區(qū)（拮抗肽 PT7 替換 CDR3）構象進行模擬。以單域抗體 PTVH5（拮抗肽 PT2、PT3、PT4 依次替換 CDR1、CDR2、CDR3）構象為基礎，通過通用連接肽 (GGGGS)3與構建的人抗體輕鏈可變區(qū)構象進行組合，形成單鏈抗體 scFv，利用Homology 模塊對 scFv 構象進行模擬。

1.2.2 力學優(yōu)化 依次選擇 CVFF、Gromos96力場，經(jīng)最陡下降（收斂步長 6000，收斂判據(jù)0.05 kJ/mol）、共軛梯度（收斂步長 10000，收斂判據(jù) 0.01 kJ/mol），利用 Discover_3 模塊對獲得的輕鏈可變區(qū)及 scFv 構象進行最小化處理。

1.2.3 分子對接 基于 TNF 晶體結構（PDB 號：1tnf）以及 TNF/Z12 相互作用復合物模型，利用Docking 4.0 對獲得的 scFv 與 TNF-α 作用的復合物結構進行模擬。

1.2.4 反向翻譯 針對理論設計獲得的 ScFv_AB1 氨基酸序列，利用 www.expasy.ch/tool 中的 Reverse Translate 程序對其進行反向翻譯，得到其 DNA 序列。選擇 Remicade 的單鏈抗體形式作為陽性對照（命名為 S-Remicade），按照 S-Remicade 的氨基酸序列進行反向翻譯，確定其 DNA 序列。考慮到原核表達系統(tǒng)，在翻譯過程中選用偏好密碼子。

1.2.5 重組蛋白表達質粒的構建、誘導表達及復性純化 對于獲得的 ScFv_AB1、S-Remicade 的基因序列，通過 Overlap PCR 方法進行全合成。通過 DNA 片段和質粒的酶切、連接反應、轉化 JM109 感受態(tài)細胞，挑取單克隆，利用 PCR 方法和酶切方法進行鑒定。

利用重組質粒誘導表達、包涵體復性、重組蛋白純化獲得新抗體。

1.2.6 與 TNF-α 的結合試驗 以 TNF-α（1 μg/ml）包被酶標板，4 ℃過夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入不同濃度（0.22、0.44、0.88、1.75、3.5 μmol/L）的 ScFv_AB1，37 ℃孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入鼠抗 His 抗體（1:5000），37 ℃孵育 1 h；TBST洗滌 3 遍，加入二抗 GAM-HRP（1:3000），室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物顯色液，室溫顯色 10 min，2 mol/L H2SO4終止反應；492 nm 波長下測值。以 S-Remicade 為陽性對照，帶 His-tag 的無關蛋白為陰性對照，所有反應液均為每孔 50 μl。

1.2.7 競爭抑制試驗 以 TNF-α（1 μg/ml）包被酶標板，4 ℃過夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 Z12-HRP（1:1600）與不同濃度 ScFv_AB1 的混合液，室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物，室溫顯色 10 min，2 mol/L H2SO4終止反應；492 nm 波長下測值。以 IgG 嵌合抗體作對照，所有反應液均為每孔 50 μl。

抑制率按以下公式計算：

抑制率 =ODZ12 – HRP – ODZ12 – HRP + ScFv_AB1× 100% ODZ12 – HRP

1.2.8 抑制 TNF-α 與 TNFR 結合的實驗 以TNFRI 或 TNFRII（1.25 μg/ml）包被酶標板，4 ℃過夜；TBST 洗滌 1 遍，10%胎牛血清 37 ℃封閉 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 TNF-HRP（1:800）與不同濃度 ScFv_AB1 的混合液，室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3 遍，加入 OPD 底物，室溫顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止反應；492 nm 波長下測值。以 S-Remicade 為陽性對照，IgG 嵌合抗體為陰性對照，所有反應液均為每孔 50 μl。

抑制率按以下公式計算：

抑制率 =ODTNF – HRP – ODTNF – HRP + Inhibitor× 100% ODTNF – HRP

1.2.9 對 TNF-α 細胞毒的抑制實驗 將生長狀態(tài)良好的 L929 細胞用胰酶消化，接種于 96 孔板，3 × 104個/孔，每孔 80 μl，加入終濃度為 1 μg/ml 的放線菌素 D（dactinomycin D）；加入 TNF-α（終濃度為 10 ng/ml）與不同濃度（0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml）的 ScFv_AB1混合液，每孔 20 μl，37 ℃培養(yǎng) 20 h；加入 MTT（5 mg/ml），每孔 10 μl，37 ℃培養(yǎng) 4 h；加入 MTT 終止液（0.01 mol/L HCl、10% SDS），每孔 100 μl，37 ℃或室溫 8 h；測 570 nm值。以 S-Remicade、Remicade 為陽性對照，IgG 嵌合抗體為陰性對照。

抑制率按以下公式計算：

抑制率 =

ODdactinomycin D + TNF + Inhibitor – ODdactinomycin D + TNF× 100% ODdactinomycin D – ODdactinomycin D + TNF

2 結果

2.1 單鏈抗體 scFv 的設計及空間結構模擬

在單域抗體 PTVH5 的基礎上，以七類 VL框架為輕鏈候選支架，用活性較好的拮抗肽 PT7 替換 VL框架的 CDR3 區(qū)，并以(GGGGS)3作為柔性linker，設計新型 scFv 分子，設計中所用的 4 個 TNF-α 拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）的氨基酸序列及其在 scFv 中的位置見表 1，組成 7 個 scFv 分子的 VH、VL類型見表 2。

在同源模建過程中，由于靜電斥力和空間位阻的影響，有些 scFv 的三維結構因不合理且不穩(wěn)定，不能通過同源模建的方法搭建，因此只獲得了3 個 scFv 分子的三維結構模型（ScFv_AB1、ScFv_AB3、ScFv_AB5），如圖 1 所示。

2.2 單鏈抗體 scFv 與 TNF-α 相互作用復合物的結構預測

借助理論設計獲得的新型分子 scFv 空間構象（圖 1），以 TNF 晶體結構（PDB號：1tnf）為模板，考慮靜電互補、結構匹配，通過 TNF/Z12 相互作用的空間結構模式，構建 scFv 與 TNF-α 相互作用的立體結構，經(jīng)分子力學、動力學優(yōu)化獲得復合物的常溫穩(wěn)定構象（圖 2）。從圖 2 可以看出，設計獲得的新型單鏈抗體分子 ScFv_AB1、ScFv_AB3、ScFv_AB5 均能夠與 TNF-α 作用。

表 1 TNF-α 拮抗肽的氨基酸序列及在 scFv 中的位置

表 2 組成 scFv 的 VH、VL類型

2.3 scFv 與 TNF-α 相互識別位點判別

根據(jù)模建獲得的 3 個新型 scFv 分子與 TNF-α 相互作用的復合物模型，通過距離幾何學、計算機圖形學技術分析它們各自所識別的 TNF-α 的位點及相關位置。從表 3 可以看出，ScFv_AB1 與 TNF-α 的作用區(qū)域較廣，識別的活性氨基酸（位于活性部位的氨基酸）和總氨基酸較多。3 個 scFv 分子都分別能識別 TNF-α 3 個活性部位中的兩個，但 ScFv_AB1 能夠完整地識別 141 ~ 146 位，其他兩個 scFv 分子只能部分識別這一活性表位。該表位也是單抗 Z12 識別并中和 TNF-α 活性的主要位點。鑒于此，ScFv_AB1 最有可能會中和 TNF-α 的毒性作用。

進一步分析 scFv 與 TNF-α 形成的復合物模型可以發(fā)現(xiàn)，ScFv_AB1 中參與識別 TNF-α 的氨基酸殘基最多，ScFv_AB1 中 HCDR2（61 ~ 77）、HCDR3（110 ~ 125）、LCDR3（239 ~ 254）參與了識別 TNF-α；而 ScFv_AB3 和 ScFv_AB5 中，僅 HCDR2（61 ~ 77）和LCDR3（240 ~ 255）參與了識別作用，HCDR3（110 ~ 125）幾乎不發(fā)揮作用。

綠色飄帶為 VL框架；粉色飄帶為 VH框架；黃色飄帶為 linker；藍色為 LCDR3（PT7）；深黃色為 HCDR1（PT2）；白色為 HCDR2（PT3）；紅色為 HCDR3（PT4）

Figure 1 The 3-D structure model of scFv molecule based on homology modeling method

綠色線條為 TNF 三聚體，綠色球為 TNF 被識別的表位；紅色線條為 VL框架，紅色球為 LCDR3（PT7）；粉色線條為 VH框架，粉色球為 HCDR3（PT4）；黃色線條為 linker

Figure 2 The complex structure of TNF and scFv based on computer-guided molecular docking and dynamics simulation methods

表 3 scFv 分子識別 TNF 三聚體的區(qū)域

注：A、B、C 分別代表 TNF 三聚體中的 3 個單體；aa：氨基酸。

Notes: A, B and C represent the three monomer of TNF trimer, aa: amino acid.

紅色、粉色和綠色球分別代表 VL、VH和 TNF-α 中發(fā)生相互作用的氨基酸殘基

Figure 3 The localization analysis of the binding domain between scFv and TNF-α

很多研究表明，HCDR3 和 LCDR3 在與抗原結合中發(fā)揮主要作用，而 HCDR3 看起來比 LCDR3 更關鍵[25-26]。由此可見，理論上，ScFv_AB1 的活性要明顯好于 ScFv_AB3 和 ScFv_AB5。

2.4 scFv 分子與 TNF-α 相互識別模式分析

利用計算機圖形學技術，結合 scFv 與 TNF-α 相互識別位點，確定了 scFv 與 TNF-α 識別區(qū)域的結構特征，如圖 3 所示，ScFv_AB1 與 TNF-α 作用堆積最為緊密，相互識別的范圍較廣，而 ScFv_AB3、ScFv_AB5 與 TNF-α 作用面接觸較差，作用分散。

根據(jù)所設計的 3 個scFv分子與 TNF-α 相互作用的復合物模型，分別計算它們與TNF-α 相互作用的自由能。從表 4 中可以看出，在 3 個 scFv 分子中，ScFv_AB1 與 TNF-α 之間作用的自由能最低，結合 TNF-α 的作用最強。

2.5 反向翻譯獲得 ScFv_AB1的 DNA 序列

選擇偏好密碼子，將 ScFv_AB1 的氨基酸序列反向翻譯成 DNA 序列，長 795 bp，需要全合成的部分為 420 bp（圖 4）。將 ScFv_AB1 序列中需要合成部分的正鏈和負鏈 DNA 各分成6 段，正鏈與負鏈中的相應兩段重疊 18 ~ 22 bp，有利于 PCR 過程的延伸。分析每段的二級結構，修改堿基，消除過多的發(fā)夾結構，便于 PCR 擴增。

2.6 新型單鏈抗體 ScFv_AB1 的生物學活性

2.6.1 與 TNF 的特異性結合 ELISA 結果表明，ScFv_AB1 能夠與包被在酶標板上的 TNF-α 結合（圖5A），結合能力隨著 ScFv_AB1 的濃度增加而增加，帶 His-tag 的無關蛋白不能與 TNF-α 結合。

表 4 理論模型下的 scFv 分子與 TNF 的相互作用能（kCal/mol）

Z12-HRP 與不同濃度的 ScFv_AB1 混合，競爭與 TNF-α 結合。競爭 ELISA 的結果顯示，ScFv_AB1 可以與 Z12-HRP 競爭結合包被在酶標板上的 TNF-α，競爭抑制率隨著ScFv_AB1 的濃度增加而增加。這表明 ScFv_AB1 和 Z12 一樣，能與 TNF-α 的 141 ~ 146 功能表位結合，預示著ScFv_AB1 能中和 TNF-α 的活性（圖5B）。

2.6.2 ScFv_AB1 抑制 TNF-α 與 TNFR 的結合 ScFv_AB1 能與 TNF-α 結合，這促使我們進一步去驗證 ScFv_AB1 是否能阻斷 TNF-α 與 TNFR 的結合。結果表明，ScFv_AB1 能以濃度依賴方式阻斷 TNF-α 與 TNFRI（圖6A）、TNFRII（圖6B）的結合，從而可能抑制 TNF-α 的生物活性。ScFv_AB1 濃度為 3.5 μmol/L 時，抑制率達到60% 以上。

圖 4 ScFv_AB1 的氨基酸序列反向翻譯成 DNA 序列

Figure 4 The reverse translation of ScFv_AB1

OD4920.90.80.70.60.50.40.30.20.10 競爭 Z12 結合 TNF百分率（%）Inhibition of mAb Z12 bindingto TNF (%)706050403020100 1 2 3 4 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)A 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)B

Figure 5 The specific binding of ScFv_AB1 and TNF (A: The binding between ScFv_AB1 an TNF; B: The competition binding between ScFv_AB1 and Z12)

抑制 TNF 與 TNFRI 結合百分率（%）Inhibition of TNF bindingto TNFRI (%)9080706050403020100 抑制 TNF 與 TNFRII 結合百分率（%）Inhibition of TNF bindingto TNFRII (%)80706050403020100 1 2 3 4 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)A 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)B

Figure 6 Inhibition of ScFv_AB1 to TNF and TNFR (A: Inhibition of TNF and TNFRI; B: Inhibition of TNF and TNFRII)

2.6.3 ScFv_AB1 對 TNF-α 細胞毒的抑制效應 鼠成纖維細胞 L929 為 TNF-α 特異敏感的靶細胞。實驗中，在 10 ng/ml rhTNF-α 的作用下，70% 的 L929 細胞發(fā)生凋亡，凋亡的程度與 TNF-α 的活性成正相關。ScFv_AB1 可明顯抑制 TNF-α 對 L929 細胞的毒性作用（圖7），但其抑制活性與 S-Remicade 和 Remicade 相比要弱。

抑制 TNF 介導細胞毒百分率（%）Inhibition of TNF inducedcytotoxicity (%)9080706050403020100 1 2 3 4 濃度（μmol/L）Concentration (μmol/L)

Figure 7 Inhibition effect of ScFv_AB1 on TNF-α induced cytotoxicity

3 討論

研究證實，源于 TNF-α 中和性抗體的 CDRs 的短肽，或是根據(jù)其 CDRs 合理設計的短肽，都能夠與 TNF-α 結合，其特異性與母本抗體相似，但其活性離臨床應用相距甚遠[27-28]。分析原因可能是：自由的肽可以擁有多種空間構象，可能只有一小部分有利的構象適于與抗原分子結合；而且肽分子太小，不具備足夠的空間位阻以阻斷抗原與其受體的結合[29]。所以，需要一個合適的框架來支撐自由的肽，以求獲得有利的空間構象、穩(wěn)定的三級結構和足夠的空間位阻。

已有很多蛋白框架被開發(fā)用于拮抗分子的構建[30]。在課題組前期的研究中，曾用人 IgG1 的Fc 片段及人抗體可變區(qū)的 VH5 框架來展示 TNF-α 拮抗肽[20-21]。結果表明，與單獨的肽相比，新構建的拮抗分子的活性明顯提高，而且抗體可變區(qū)框架比 Fc 片段更適于作為支架來展示拮抗肽，這促使我們利用這一合理的設計策略進一步去開發(fā)活性更好的拮抗分子。

在這部分工作中，以前面設計的單域抗體 PTVH5（以 VH5 為框架）為基礎，從七類輕鏈可變區(qū)框架中選擇與之匹配的 VL框架，以通用的(GGGGS)3為連接肽，設計新型單鏈抗體，其中 VL框架的 CDR3 被拮抗肽 PT7 取代。由于前期研究已顯示 LCDR1 和 LCDR2 在與 TNF-α 的結合中不起主要作用[17, 20]，所以取代不涉及 LCDR1 和 LCDR2。經(jīng)過同源模建和分子對接，搭建 TNF/scFv 復合物模型。分析發(fā)現(xiàn)，以 VH5 和 Vκ1 為框架設計的 ScFv_AB1 與 TNF-α 之間的結合能力較 ScFv_AB3、ScFv_AB5 強，能夠識別TNF-α 中重要的活性表位 141 ~ 146 位。

純化的 ScFv_AB1 能夠與 TNF-α 結合、競爭性抑制 Z12-HRP 與 TNF-α 的結合、抑制 TNF-α 介導的細胞毒作用。但與 S-Remicade 相比，ScFv_AB1 的活性要弱。最大的可能性是，ScFv_AB1 是在 VH5 框架的基礎上設計的，而 VH5 與Vκ1 可能并非是最佳組合。其他的可能性還有 ScFv_AB1 與 TNF-α 間較弱的氫鍵作用、拮抗肽的效力等。如果進一步模建時考慮所有的 VH和 VL框架，確定拮抗肽的最佳展示位置，可能會獲得活性更好的拮抗分子。

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Novel human single chain antibody design based on the functional epitope of TNF

CHANG Hong, Lü Ming, QIAO Chun-xia, LI Xin-ying, GENG Jing, ZHOU Ting-ting, LIN Zhou, SHEN Bei-fen, FENG Jian-nan

Developed novel human single chain antibody which design based on the functional epitope of TNF.

In a previous study, we obtained a TNF-α neutralizing mAb Z12 and identified the epitope (from 141 to 146 aa in TNF-α) recognized by Z12. Moreover, we explored a series of TNF-α antagonist peptides (. PT2, PT3, PT4 and PT7) and the single domain antibody PTVH5 (using human antibody frame work of variable region of heavy chain,VH5, as scaffold to display the peptides PT2, PT3 and PT4) based on the interaction between TNF-α and mAb Z12. In the present work, based on the computer-guide molecular design, homology modeling and molecular docking method, we used human antibody frame work of variable region of light chain (Vκ1) as dispalying scaffold and obtained a novel single chain antibody, named as ScFv_AB1, according to the conformation, binding energy and identified domain.

Theoretical analysis showed that ScFv_AB1 was stable and recognized the position 141-146 of TNF-α (same as Z12). Biological experiments showed that ScFv_AB1 could bind to TNF-α, competitively inhibit the binding of mAb Z12 to TNF-α, block the binding of TNF-α to TNFR and inhibit TNF-induced cytotoxicity.

This study demonstrated that it is feasible to design novel single chain antibody based on human antibody consensus frameworks and antagonist peptides using computer-guided modeling method. It also provides an alternative way to obtain human small molecular antibody.

Tumor necrosis factor-alpha; Single-chain antibodies; Computer-aided design; Scaffolds; Homology modeling; Antagonist peptide

SHEN Bei-fen, Email: shenbf0714@163.com; FENG Jian-nan, Email: fengjiannan1970@qq.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.001

國家自然科學基金面上項目（31070820）

沈倍奮，Email：shenbf0714@163.com；馮健男，Email：fengjiannan1970@qq.com

2014-05-28

Author Affiliations: Institute of Basic Medical Sciences, Acadamy of Military Medical Sciences; School of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China (CHANG Hong, Lü Ming, QIAO Chun-xia, LI Xin-ying, GENG Jing, ZHOU Ting-ting, LIN Zhou, SHEN Bei-fen, FENG Jian-nan); Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China (CHANG Hong)