呂衛(wèi)東，李俊鑫，劉綠艷，李欣，崔璐璐，萬曉春

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人OX40胞外區(qū)基因的克隆、原核表達及單克隆抗體的制備

呂衛(wèi)東，李俊鑫，劉綠艷，李欣，崔璐璐，萬曉春

518055 深圳，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院（呂衛(wèi)東、李俊鑫、劉綠艷、萬曉春）；121000 錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（李欣、崔璐璐）

制備抗人OX40 單克隆抗體，為進一步研究OX40/OX40L 通路以及針對該通路進行疾病干預(yù)、疾病治療和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

PCR擴增人OX40 胞外區(qū)的基因序列，將其構(gòu)建到原核表達載體pET-32a(+) 中，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達OX40 胞外區(qū)蛋白，經(jīng)Ni 柱純化后獲得目的蛋白。以純化的OX40 胞外區(qū)蛋白為免疫原免疫小鼠，采用常規(guī)方法進行細胞融合，通過ELISA和多次克隆化培養(yǎng)，篩選出分泌特異性鼠抗人OX40 單克隆抗體的雜交瘤細胞株；通過ELISA、Western blot 和免疫熒光檢測抗體的效價及特異性。

成功構(gòu)建人OX40 原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)-OX40，并在BL21(DE3) 中誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot 鑒定、Ni 柱純化、透析后獲得OX40 胞外區(qū)蛋白；以此純化蛋白為免疫原，成功制備具有較強親和力的單克隆抗體。

克隆表達并純化了人OX40 蛋白，成功制備針對該蛋白的高親和力單克隆抗體，為進一步研究OX40/OX40L 的生物學(xué)功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

受體，OX40； 基因表達； 抗體，單克隆

OX40（CD134）屬于 TNFR 超家族成員之一，為 I 型跨膜糖蛋白，主要表達在活化的 CD4+和 CD8+T 細胞表面，其配體 OX40L 在活化的 B 細胞、樹突細胞和內(nèi)皮細胞上均有表達[1-2]。在機體的免疫應(yīng)答過程中，OX40/OX40L 作為一對重要的共刺激分子，為 T、B 細胞的激活提供了重要的共刺激信號，其信號傳導(dǎo)也與效應(yīng)細胞存在和功能相關(guān)[3-4]。由于 OX40/OX40L 在機體的免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，并隨著生物學(xué)功能的進一步揭示逐漸成為臨床干預(yù)自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的一個理想靶點[5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pET32a(+)、pLVX-IRES-ZsGreen、BL21(DE3)、HEK293T 細胞由本實驗室保存；人 OX40 基因全長 ORF 克隆購自北京義翹神舟生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT 及 PEG4000 購自美國 Sigma 公司；限制性核酸內(nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量標記均購自日本 Takara 公司；T4 DNA 連接酶為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。6~ 8 周齡 SPF 級BALB/c 雌性小鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 pET32a(+)-OX40 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以人全長 OX40 cDNA 為模板，上游引物 F：CATGAACTCCACTGTGTCGGGGACACC，下游引物 R：CCCTTAGATGGCGGCA ACCGCACG（下劃線分別為I和d III酶切位點），擴增 OX40 基因。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 50 s，52 ℃復(fù)性 35 s，72 ℃延伸 50 s，29 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳及膠回收后連接到原核表達載體 pET32a(+) 上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)，經(jīng)I和d III雙酶切鑒定的陽性克隆送至Invitrogen 公司測序。

1.2.2 OX40 蛋白的原核表達、鑒定及純化 將測序正確的菌株接種于 3 ml LB 氨芐培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600= 0.6 ~ 0.8，加入至終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，于 37 ℃誘導(dǎo)表達，4 h 后分別取菌液 1 ml 離心收集菌體，SDS-PAGE 電泳分析目的蛋白的表達情況，并用 HRP 標記的 Anti-His 抗體對其進行 Western blot 檢測。

1.2.3 OX40 蛋白純化 驗證正確的陽性菌擴大培養(yǎng)后，離心收菌體，用 PBS 重懸后超聲破碎，離心后取上清，用 0.45 μm 的濾器過濾，上樣于 Ni-Seproase 6FF 親和柱，經(jīng)鎳柱親和純化后，取少量上清液做 12% 的 SDS-PAGE 電泳驗證蛋白純化效果。其余上清液轉(zhuǎn)移至超濾管中于 4 ℃條件下離心，濃縮蛋白，采用 Bradford 法測定蛋白濃度，并于–80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 OX40 免疫小鼠及滴度測定 將純化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，初次免疫100 μg/只，將蛋白與弗氏完全佐劑 1:1 比例完全乳化后，皮下多點注射。間隔 2 周后，進行第 2 次免疫，將蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后，皮下多點注射，100 μg/只。間隔 2 周后第 3 次免疫，方法同第 2 次。第 3 次免疫后眼眶取血測定抗體滴度。OX40 包被 ELISA 板，20 ng/孔，4 ℃包被過夜，5% 的脫脂奶粉 37 ℃封閉 1 h，PBS-T 洗滌 3 次后加入系列稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育 1 h，用 PBS-T 洗滌 3 次，加 HRP 標記的羊抗鼠 IgG 二抗（1:8000）孵育 30 min。用 PBS-T 洗滌 3 次，TMB避光顯色 10 min，2 mol/L 的硫酸終止反應(yīng)，酶標儀 450 nm 測定值。

1.2.5 OX40 單克隆抗體的制備 選取滴度高的小鼠，腹腔注射 100 μg/只加強免疫，3 d 后取脾臟，采用 PEG 法與Sp2/0 細胞融合。HAT 培養(yǎng)基加壓篩選并克隆化篩選陽性克隆，雜交瘤細胞接種 BALB/c 小鼠，制備并純化抗 OX40 抗體。

1.2.6 免疫熒光法測定 mAb 對膜表面 OX40 的識別 將培養(yǎng)的 293T 細胞以 1 × 105個/ml 的細胞密度接種到放置預(yù)處理的蓋玻片的 24 孔板中，利用脂質(zhì)體將 pLVX-IRES-ZsGreen 及 pLVX- IRES-OX40-ZsGreen 分別轉(zhuǎn)染到 293T 細胞中，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。用冰冷的 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用 3.7% 的多聚甲醛于室溫固定30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。1% BSA 室溫封閉 30 min 后，加入 1% BSA 稀釋的抗 OX40 單抗，于室溫孵育 1 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min。加入 1:400 稀釋的 Dylight594 標記的羊抗鼠二抗于室溫孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次5 min。利用抗淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot 測定 mAb 對膜表面 OX40的識別特異性 利用脂質(zhì)體將 pLVX-IRES-ZsGreen及 pLVX-IRES-OX40-ZsGreen 分別轉(zhuǎn)染到 293T 細胞中，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后收集細胞。細胞經(jīng)預(yù)冷的 RIPA 抽提后，將獲得的膜蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后用 5% 脫脂奶粉于 37 ℃封閉 1 h，之后于 37 ℃用制備的單抗進行孵育，HRP 標記的羊抗鼠 IgG 抗體作為二抗，分別孵育 8F8 株，4H11 株表達上清及羊抗鼠二抗，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的構(gòu)建與鑒定

以人全長 OX40 cDNA 為模板，設(shè)計上、下游引物通過 PCR 擴增 OX40 胞外區(qū)基因，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示目的片段大小為 576 bp，與預(yù)期值相符（圖 1）。OX40 基因片段與原核表達載體 pET32a 經(jīng)過雙酶切后通過 T4 連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取克隆進行菌落 PCR驗證，1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示電泳條帶與預(yù)期值相符（圖 2），確定表達載體 pET32a-OX40 構(gòu)建正確。

bp M 1 2000 1000750500 250100

Figure 1 PCR products of the extracellular domain of OX40

bp M 1 2 3 4 5 6 7 2000 1000750500 250100

Figure 2 The clone PCR results of transformants

2.2 融合蛋白的表達及鑒定

將陽性菌于 37 ℃，0.2 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)表達過夜，細菌經(jīng)超聲波破碎后離心取上清進行 SDS-PAGE（圖 3），與空載對照相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)物在 38 kD 處有明顯的條帶，表達產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。Western blot 分析結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量約 38 kD 處有明顯條帶，與預(yù)期值相符。

2.3 表達產(chǎn)物的純化及 SDS-PAGE 鑒定

表達菌體經(jīng)超聲破碎后離心上清上樣于Ni-Seproase 6FF 親和層析柱，經(jīng)200 mmol/L 咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫后得到純化的目的蛋白（圖 4），經(jīng) Bradford 法測定蛋白濃度，純化后的 OX40 蛋白的濃度為 400 μg/ml。

Figure 3 IPTG-induced expression ofOX40

kD M 1 2 3 4 1701301007055 40 35 25 15

Figrue 4 SDS-PAGE analysis of purified OX40

2.4 OX40 抗體效價測定

純化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，第3 次免疫后眼眶取血利用間接ELISA 法測定抗OX40 抗體的效價，由圖 5 可知，免疫 OX40 后，產(chǎn)生了高效價的抗 OX40 抗體。

2.5 單克隆抗體的制備及特異性鑒定

利用 PEG 法進行細胞融合，共融合 10 塊96 孔板。將復(fù)測為陽性的克隆連續(xù)進行 2 次克隆化，獲得兩株穩(wěn)定的抗人 OX40 的雜交瘤細胞株。間接免疫熒光檢測表明，這兩株單抗均能識別 293T細胞表面表達的 OX40 蛋白（圖 6）。Western blot分析結(jié)果顯示，這兩株單抗均能與 293T 表達的OX40 蛋白特異性結(jié)合，空載對照組則無相應(yīng)條帶（圖 7）。

OD4504.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1234567 抗血清稀釋倍數(shù)The proportion of antiserum dilution

Figure 5 The titer of antiserum determined by indirect ELISA

圖 6 免疫熒光檢測 OX40 單抗的特異性（1：空載對照；2：同型抗體對照；3：8F8 株；4：4H11 株）

Figure 6 Identification of OX40 mAb by immunofluorescence (1: Negative control of pLVX-IRES-ZsGreen plasmid; 2: IgG isotype control; 3: 8F8 cell line; 4: 4H11 cell line)

1 2 3

Figure 7 Western blot analysis of OX40 mAb

3 討論

OX40/OX40L 已被證實在炎性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤及移植排斥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[6-7]。通過對其干預(yù)所進行的免疫治療在動物模型上已取得較好的效果[8]。干預(yù) OX40/OX40L 途徑已經(jīng)作為治療許多臨床慢性炎性反應(yīng)性疾病的目標之一[9-10]。

本研究通過基因工程手段克隆得到 OX40 胞外區(qū)片段并在原核細胞中高效表達，純化后用于免疫 BALB/c 小鼠，通過雜交瘤技術(shù)、單克隆抗體篩選及抗體純化技術(shù)獲得高效價的抗 OX40 抗體。通過 ELISA 和免疫熒光鑒定所制備的單克隆抗體具有良好的特異性和高度的親和力，為進一步研究 OX40/OX40L 的生物學(xué)活性及進一步尋找針對 OX40/OX40L 通路的治療藥物奠定了實驗基礎(chǔ)。

目前對于 OX40 分子抗腫瘤機制的研究還處于起步階段，但已有的實驗結(jié)果是振奮人心的[11]。將 OX40 分子作為腫瘤免疫治療的新靶點已顯現(xiàn)出了積極的作用。而抗人 OX40mAb 的成功研制，為深入研究 OX40/OX40L 分子的作用以及信號通路提供了有力的新工具[12]。相信隨著對 OX40 分子研究的深入，將會為協(xié)同刺激分子在腫瘤及其他疾病的免疫學(xué)治療等方面提供更有價值的線索和幫助。

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Prokaryotic expression of the extracellular region of human OX40 and preparation of its antibody

Lü Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, LI Xin, CUI Lu-lu, WAN Xiao-chun

To prepare novel anti-OX40 functional monoclonal antibodies and characterize their distinct biological functions.

The gene fragment of extracellular region of OX40 was amplified by PCR and cloned into pET-32a(+) prokaryotic expressing vector. The expressed products were purified by Ni sepharose and identified by Western blot. The purified recombinant protein was used as antigen to immunize BALB/c mice. Then the immunized spleen cells were isolated from immunized mice and fuse with Sp2/0, a kind of myloma. After screening by ELISA, hybridomas secreting anti-OX40 mAb were acquired and used to generate specific Abs. At last, biological activities of Abs were investigated by ELISA, Western blot.

The recombinant OX40 extracellular domain protein was successfully expressed in BL21 and purified by Ni sepharose. It was a protein with about 38 kD molecular weight as analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The data of FACS demonstrated that the antiserum had high affinity to OX40 expressed on the membrane of OX40-transfected cells.

The purified protein OX40 has been successfully obtained. The prepared monoclonal antibody shows high specificity and titer in immunized mice. The preparation of recombinant OX40 and its monoclonal antibody has provided reliable tools for the future study on the biologic activity of OX40/OX40L.

Receptors, OX40; Gene expression; Antibodies, monoclonal

WAN Xiao-chun, Email: xc.wan@siat.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.006

深圳市孔雀計劃團隊引進資助項目（Y2A206）

萬曉春，Email：xc.wan@siat.ac.cn

2014-07-08

Author Affiliations: Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Shenzhen 518055, China (Lü Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, WAN Xiao-chun); College of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou121000, China (LI Xin, CUI Lu-lu)