王太武，柴雅明，林 輝，黃國榮，向 穎，吳 龍，鄔 娜，熊鴻燕

(第三軍醫(yī)大學軍隊流行病學教研室，重慶 400038)

噬菌體酶作為噬菌體裂解細菌的關鍵酶，越來越受到研究者的重視［1-3］。蛋白重組技術正是獲得純化噬菌體酶的方法之一，其能夠獲得純化的噬菌體酶蛋白作為新的滅菌藥物進行下一步研究;噬菌體展示技術也可以將目的蛋白DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，用以探索基因功能等方面的研究。在前期工作中，獲得了1株烈性噬菌體LSB-1并對其部分基因組測序，通過生物信息學對序列進行分析，找到與噬菌體溶解細菌密切相關酶基因gp17［4］。基于前期的探索結果，本實驗擬對噬菌體LSB-1內溶素基因進行克隆、表達以獲得純化目的蛋白，同時采用噬菌體展示技術獲得重組噬菌體T7-LSB-gp17，觀察兩者對細菌的生物活性，并比較活性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

LSB-1噬菌體、EIEC8401為第三軍醫(yī)大學軍隊流行病學教研室儲備，于 －70℃保存，pET300質粒購自生工公司，黏液腸埃希菌BLT5403和T7噬菌體為T7 Select Cloning Kit試劑盒自帶;BCA蛋白含量測定試劑盒、高速臺式冷凍離心機(Sigma)、蛋白質純化分離系統(tǒng)、9700PCR System(Applied Bio-systems公司)、恒溫培養(yǎng)箱(湘儀)、電泳儀(Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體目的基因的擴增 根據基因組測序獲得LSB-1噬菌體內切唾液酸酶的gp17基因序列和引物設計的基本原則，用Primer Premier 5.0引物設計軟件進行引物設計，送上海Invitrogen生物技術有限公司合成，序列如下:GP17E-1:5'-TATG TCCACGATTACACAATTCCCTTC-3'，其中CCG為保護堿基，為EcoR I酶切序列;GP17H-2:5'TTC GCTGTAAACAAATCCGATTC-3'，其中為保護堿基為Hind III酶切序列，上游引物上添加酶切位點EcoR I，下游引物上加酶切位點Hind III。培養(yǎng)LSB-1噬菌體，提取噬菌體DNA［5］為模板，構建PCR反應體系，擴增gp17基因。反應結束后，電泳檢測并回收。

1.2.2 目的基因的克隆、轉化及鑒定 PCR擴增產物和質粒pET300經過瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收目的片段并純化。取純化后的PCR產物和pET300質粒分別經過EcoR I、Hind III酶切后，進行連接反應取純化后的PCR產物和pET300質粒進行連接反應。連接完成后，取6 μL連接產物轉化感受態(tài)細胞BL21，用含有氨芐的瓊脂平板篩選，37℃孵育18 h，挑取平板上的菌落增菌后提取質粒，酶切后送上海生工生物工程公司進行測序鑒定目的序列。

1.2.3 噬菌體目的基因gp17的純化表達 ①重組細菌的誘導表達和純化:將測序正確的重組工程菌接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至A600nm值約為0.6時加入IPTG使終濃度為0.5 mmol/L誘導表達10 h，離心，收集誘導表達的重組細菌沉淀與裂解液按1 g∶20 mL的比例混合，在冰浴中超聲破菌。離心分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白表達形式。隨后對目的蛋白依次采用Ni柱、SuperdexG200、SUMO 酶去除 pET300、Ni柱、G25 脫鹽、DEAE、G75精制最終得到6xhis-gp17目的蛋白，并在純化過程中各步留樣作SDS-PAGE電泳分析。將純化后的目的蛋白濃縮凍干，取凍干產物，用0.01 mol/L的PBS溶解。用BCA法測定蛋白濃度后，分裝并置于－20℃保存?zhèn)溆?②重組蛋白活性抑菌譜觀察:采用擴散試驗法［6］，取培養(yǎng)好的待測細菌1 mL，平鋪在倒好瓊脂的平板上，吸去多余菌液，待干燥后在平板放上高壓滅菌試紙片，分別滴加5 μL的目標蛋白，陰性對照加入PBS緩沖液，置于37℃孵箱培養(yǎng)觀察效果。

1.2.4 重組噬菌體 T7-LSB-gp17的構建 ①目的基因與載體的連接及噬菌體的組裝:從測序正確的重組細菌中提取載體質粒，酶切提取gp17基因純化片段，將載體純化片段、LSB-1噬菌體gp17基因純化片段和T4連接酶進行構建連接反應體系，16℃過夜連接。然后取5 μL連接產物加入到25 μL T7 packaging extracts中，室溫連接 2 h，加入270 μL LB培養(yǎng)基終止反應。重組后的噬菌體基因經殼蛋白提取物包裝后感染黏液腸埃希BLT5403，挑取單個噬菌斑，用液體培養(yǎng)法大量擴增;②重組噬菌體的純化:將培養(yǎng)好的重組噬菌體0.1 mL與BLT5403菌用雙層瓊脂法鋪板，4 h后從雙層瓊脂培養(yǎng)板上挑取透明、直徑大的單個噬菌斑，放入20 mL BLT5403菌液中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。重復此步驟3次或以上，最后使觀察到的噬菌斑的大小和形態(tài)均勻一致，即得到了純化的重組噬菌體。將重組噬菌體原液與甘油(分析純)以4∶1比例混合后注入1.5 mL滅菌EP管中，放于－70℃冰箱長期保存;③重組噬菌體的鑒定:提取重組噬菌體DNA，并用試劑盒自帶引物進行擴增，連接到質粒、轉化、質粒抽提后進行測序及序列驗證。同時對宿主細菌、T7噬菌體以及T7-LSB-gp17重組噬菌體進行SDS-PAGE電泳，觀察重組噬菌體目的蛋白表達情況;④重組噬菌體活性觀察:a.雙層瓊脂法:取適當稀釋的重組噬菌體0.1 mL分別與細菌懸液0.2 mL混合，采用雙層瓊脂培養(yǎng)法鋪板，37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4～8 h，觀察噬菌斑生長狀況，確定重組噬菌體的噬菌譜;b.單層瓊脂點滴法:取培養(yǎng)好的待測細菌增菌液1 mL在單層瓊脂板上鋪板，小心吸去多余菌液，待菌液干燥后用槍頭滴5 μL重組噬菌體新鮮培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)，觀察作用效果。

2 結果與分析

2.1 目的基因的提取、克隆與載體的構建

LSB-1噬菌體基因組全長約23 kb(圖1A)，目的基因gp17長度約2000 bp(圖1B)，經測序后具體長度確定為2139 bp。與前期試驗測序的結果一致。將目的片段經PCR擴增后，與質粒連接并導入感受態(tài)細菌，培養(yǎng)、提取質粒并對目的基因進行測序，結果見圖1C顯示序列正確。

2.2 噬菌體目的基因gp17的純化表達

2.2.1 重組細菌的表達 對重組細菌加IPTG誘導培養(yǎng)，離心收集菌體，加入裂解液超聲裂解，離心，分別用沒加IPTG的對照、上清、沉淀和全菌裂解液進行SDS-PAGE電泳分析。由圖2可見，重組細菌在100 ku(因含有pET300)處有高表達，結果與理論相符，說明重組細菌成功表達了目的蛋白。沒有加入IPTG誘導培養(yǎng)的產量很低，而加入IPTG誘導培養(yǎng)的重組細菌無論是全菌液還是上清液都有很高的表達，同時加入IPTG誘導培養(yǎng)的細菌破菌液沉淀物的目標蛋白含量很低，說明IPTG成功誘導目標蛋白表達且是可溶性蛋白。

圖1 目的基因gp17的克隆和表達載體的構建Fig.1 gp17 gene cloning and expression rector construction

圖2 重組菌蛋白電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of recombinant protein

2.2.2 目的蛋白的親和層析純化 由于目的蛋白主要以可溶形式存在，故收集超聲破菌液的上清進行下一步的提純分析。首先用Ni柱純化以及G200進一步純化，將上述收集的洗脫液進行SUMO蛋白酶酶切后進行SDS-PAGE蛋白電泳，得到單獨的GP17條帶(含6×his標簽)(圖3)，然后再經過Ni柱純化、G25脫鹽、DEAE、G75精制得到最終的蛋白樣品。將得到的最終蛋白樣品溶解在 PBS緩沖液中(經 BCA法測定濃度為2.38 mg/mL)，－20℃保存。

圖3 SUMO蛋白酶酶切pET300-gp17電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of PET300-gp17 after digested by SUMO

2.2.3 GP17的抑菌譜測定 將分離得到的純化目的蛋白分別對不同的細菌采用紙片法進行抑菌譜測定。結果顯示，在所測的細菌中，目的蛋白僅對EIEC8401，即原噬菌體的宿主菌有很好的抑菌效力，對其他細菌無效(圖4)。

圖4 gp17目標蛋白對EIEC8401的作用效果Fig.4 Result of target protein to EIEC8401

2.3 重組噬菌體T7-LSB-gp17的構建與效應比較

2.3.1 重組噬菌體 T7-LSB-gp17的構建 重組后的噬菌體在約78 ku處有1條明顯比重組前的T7噬菌體表達增加的條帶 (圖5)，分析原因為實驗插入的2139 bp的核酸序列翻譯成713個氨基酸，其分子量約為78 ku，增強了此處的蛋白表達，進一步證實T7-LSB-gp17重組噬菌體構建成功。

圖5 噬菌體重組前后電泳圖Fig.5 Protein expression of phage T7-LSB-1 and phage T7

2.3.2 兩組重組產物抗菌效應的比較 采用雙層瓊脂法對重組噬菌體對EIEC8401等細菌的噬菌效果進行鑒定，發(fā)現(xiàn)重組噬菌體T7-LSB-gp17只能在BLT5403細菌形成噬菌斑 (圖6(+)、圖7(－))，說明重組后的噬菌體只能在BLT5403體內進行增殖。采用單層瓊脂法檢測T7-LSB-gp17重組噬菌體對 BLT5403、E.coli 8401、類炭疽芽胞桿菌繁殖體 (結果見圖8)、金黃色葡萄球菌 (結果見圖9)等細菌的作用效果，結果發(fā)現(xiàn)重組噬菌體T7-LSB-gp17對測試細菌均有良好的溶菌效應 (表1)。

圖6 雙層瓊脂法觀察重組噬菌體T7-LSB-gp17對BLT5403的噬菌作用Fig.6 Phagocytosis of T7-LSB-gp17 to BLT5403 by double layer agar method

表1 T7噬菌體、LSB-1噬菌體、T7-LSB-gp17重組噬菌體和重組蛋白對幾種細菌的效應對比Table 1 Comparison of the bacteriolysis of phage T7，LSB-1，T7-LSB-gp17 and recombinant protein to different bacteria

圖7 雙層瓊脂法觀察重組噬菌體T7-LSB-gp17對EIEC8401噬菌作用Fig.7 Phagocytosis of T7-LSB-gp17 to EIEC8401 by double layer agar method

圖8 噬菌體重組前后對類炭疽芽胞桿菌繁殖體溶菌作用對比Fig.8 Comparison of the Bacteriolysis with phage T7-LSB-gp17 and phage T7 to Bacillus cereus propagules

圖9 噬菌體重組前后對金黃色葡萄球菌溶菌作用對比Fig.9 Comparison of the Bacteriolysis with phage T7-LSB-gp17 and phage T7 to Staphylococcus aureus

3 討論

為了獲得特定功能的目標蛋白，采用的方式有原核表達和真核表達2種，原核表達因能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉常被采用。原核表達通過基因重組技術，將外源目的基因通過構建表達載體并導入表達菌株，使其在特定原核生物表達。本研究就通過重組技術，得到純化的可溶性的LSB-1內溶素酶，抑菌譜試驗發(fā)現(xiàn)對宿主菌EIEC8401有良好的專一抑菌效果，與其他一些研究結果相似［7］。

噬菌體展示技術［8］是近年建立和發(fā)展起來的利用噬菌體表達外源基因的一項分子生物學研究領域的新技術，是將目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面，能高效地將外源基因編碼的肽段以融合蛋白的形式展示在其外殼上。研究中采用該方法將噬菌體LSB-1內溶素基因gp17重組在T7噬菌體獲得T7-LSB-gp17重組噬菌體，并將其作用于細菌，發(fā)現(xiàn)具有良好的溶菌活性，有效細菌種類范圍較LSB-1噬菌體和純化蛋白明顯增加。

通過試驗對比，發(fā)現(xiàn)將gp17基因采用不同方法的重組表達和噬菌體展示，得到產物的有效細菌的種類卻有明顯的差別。通過分析，可能有如下原因:①本實驗中表達的噬菌體內溶素gp17基因蛋白，作用底物為多聚唾液酸，因其顯示內切活性，故又稱為內切唾液酸酶，能夠降解以α-2，8連接的多聚唾液酸產物。EIEC8401含有以 α-2，8連接多聚唾液酸構成的多糖莢膜而被重組蛋白所抑制，而其他細菌沒有或者連接方法不同因而不能有效作用。因此，酶作用位點的特異性就導致了酶的高度專一性。此外，內溶素是在噬菌體復制末期裂解細菌以釋放子代噬菌體時合成，從細菌內部作用于細胞壁，而重組純化得到的噬菌體內溶素則是由外向內作用而導致不能作用于適當?shù)奈恢?②重組噬菌體上gp17蛋白因為噬菌體載體的緣故使得gp17蛋白較純化的重組蛋白空間構象發(fā)生改變而使活性增強;③由于外源蛋白的插入，使T7噬菌體溶菌相關蛋白發(fā)生空間構象改變，T7噬菌體溶菌酶活性增強使得重組噬菌體的溶菌種類增加;也可能是上述兩者相互作用的共同結果。

近年來，隨著耐藥菌的廣泛出現(xiàn)，尋找新的抗生素的研究已經迫在眉睫，而噬菌體裂解細菌的酶類作為一個新的研究方向已引起了許多學者的關注，目前已有眾多研究者［9-10］利用該方法獲得純化的噬菌體酶作為抗菌藥物做了大量相關研究。本研究中采用了2種不同的方法對噬菌體LSB-1內溶素基因gp17的功能進行了分析，通過實驗一方面得到了純化的內溶素蛋白和重組噬菌體T7-LSB-gp17，另一方面驗證了噬菌體LSB-1基因的功能，其以后可作為抗菌藥物研究的一個方向。但是，2種不同的表達方法得到產物作用于細菌的差異結果的原因還需要進一步探索。

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