張曉琳，劉 峰，姚月婷，李亞東，周競賢，易 力，姚宇峰，俞建昆*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院＆北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118;2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650118;3.武警云南省總隊醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650111)

Harald zur Hausen因發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus)為子宮頸癌的成因于2008年獲得了諾貝爾獎。1985年 Seedorf等發(fā)表了HPV-16型的全基因組序列［1］，其NCBI登錄號為NC_001526.2。HPV病毒在99.7%宮頸癌患者中都可檢測到［2］，目前經(jīng)過對HPV的基因組分離測序已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多個型［3］。根據(jù)HPV不同型致癌危險程度不同，可將HPV分為低危型和高危型2大類，HPV-16型屬于高危型，在ICC(invasive cervical carcinoma)和CIN(cervical intraepithelial neoplasia)I-III患者中經(jīng)常被檢測到［4］。E6和E7是其2個致癌蛋白，可以誘導(dǎo)感染病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成浸潤癌。已有的研究結(jié)果顯示HPV-16型E6和E7基因的序列突變有地域性差別［5］，根據(jù)E6基因片段的DNA序列可以把HPV-16型分成6個變異亞型:E歐洲型、As亞洲型、AA亞美型、Af1(非洲-1 型)、Af2(非洲-2型)和 NA 北美型［6］。本研究收集了來自中國云南不同地區(qū)的HPV-16型病例樣本74例，通過對HPV-16型的2個致癌基因E6和E7測序分析，研究該地區(qū)E6和E7基因的變異情況和HPV-16型的變異亞型，為研究適合中國人群的宮頸癌疫苗積累流行病學(xué)方面的相關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源和HPV分型檢測

在知情同意的原則下，本研究隨機(jī)選取2012年3月至2013年3月來自昆明、曲靖、昭通、紅河等地區(qū)市縣級醫(yī)院門診、體檢及住院女性。按照上海透景HPV分型試劑盒(26型)使用說明書的要求，用配套宮頸細(xì)胞刷采集宮頸上皮細(xì)胞后漂洗到細(xì)胞保存液中，然后按照試劑盒說明書操作進(jìn)行DNA制備和分型檢測。

1.2 測序

從檢測為HPV-16的樣本中選取80例進(jìn)行E6和E7基因的DNA序列檢測。擴(kuò)增HPV-16型E6和E7基因的引物分別為:E6F(nt52～575):5'-CGAAACCGGTTAGTATAA-3'，E6R:5'-GTATCT CCATGCATGATT-3';E7F(nt480～985):5'-ATAATATAAGGGGTCGGTGG-3';E7R:5'-CATTTTCGT TCTCGTCATCTG-3'［7］。PCR 反應(yīng)體積為 25 μL，其中宮頸組織 DNA 樣品2 μL(25 ng/μL)，TaKa-Ra Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.625 U，反應(yīng)體系參照說明書。PCR循環(huán)條件:94℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物條帶在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測觀察。陽性結(jié)果的樣品送上海生工測序。對于發(fā)現(xiàn)突變的樣本再次用PCR擴(kuò)增目的片段并測序驗證突變。最終有6例樣本沒有得到測序結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

采用 Mega5.1的 Neighbor-joining方法對74個樣本的E6基因的456 bp(nt104～nt559)DNA片段序列和E7基因的297 bp(nt562～nt858)DNA片段序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(靴值法(Bootstrap method)檢驗系統(tǒng)發(fā)生樹，重復(fù)數(shù)為1000)。HPV-16型全基因組的參比序列及登錄號如下［8］:①歐洲變異型:德國變異型(European German):AF_536179;②亞洲變異型:東亞變異型(East Asian):AF_534061，中國甘肅(Gansu):EU_918764，中國新疆(Xinjiang):FJ_006723，泰國(Thailand):FJ_610152;③亞洲美洲變異型:(Asian-American):AF_402678，南美洲亞馬遜(Amazonian):HM_057182;④非洲1型變異型:(African type1):AF_472508;⑤非洲2型變異型:(African type2):AF_472509;⑥北美變異型:(North-American):U34116，由于其只含有 E6 基因序列［9］，故用E7DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹不含此變異型。

2 結(jié)果與分析

2.1 E6 DNA序列的亞型分類及堿基突變分析

2.1.1 依據(jù)E6的DNA序列的亞型分類 采用Mega5.1軟件Neighbor-joining方法對74例HPV-16 型樣本的 E6的456 bp(nt104～nt559)［10］DNA片段構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示只有亞洲變異型(49例，66.22%)和歐洲變異型(25 例，33.78%)，沒有發(fā)現(xiàn)非洲1型、非洲2型、亞-美型和北美變異型(圖1)。

亞洲變異型在178位堿基處含有突變，含有T178G為As-a亞型，含有T178A為As-b亞型，含有C178A為As-c亞型［11］。本研究發(fā)現(xiàn)44例Asa亞型，5例As-b亞型，共49例亞洲突變型。歐洲變異型可根據(jù)350位點處的突變情況分成ET350亞類、E-G350亞類和E-A350T亞類3個亞類［6］;本研究發(fā)現(xiàn)有6例E-T350G亞類。

圖2 用Mega5.1軟件Neighbor-joining方法對E7的297 bp片段構(gòu)建進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by using the 297 bp fragment of E7 gene

2.1.2 E6堿基突變分析 對74例樣本的E6基因突變分析后共檢測到14個堿基位點發(fā)生了15種堿基突變，導(dǎo)致了10種氨基酸突變。E6的顛換突變(76.19%)遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)換突變(23.81%)，且錯義突變的比重較大(89.29%)(表1)。其中堿基突變概率最高的是T178G(44例，59.46%)，導(dǎo)致了44例D25E氨基酸突變，該位點還有5例T178A堿基突變，也導(dǎo)致了D25E氨基酸突變，其突變率最高為 49例，占 66.22%;另外，1例G176A堿基突變導(dǎo)致了1例D25N突變。突變率較高的有:A276G(9例，12.16%)堿基突變導(dǎo)致了N58S氨基酸突變;T350G(6例，8.11%)堿基突變導(dǎo)致了L83V氨基酸突變。導(dǎo)致了氨基酸性質(zhì)發(fā)生改變的突變共有2例:堿基位置Q3E和堿基位置D25N(表2)。

2.2 E7 DNA序列的亞型分類及堿基突變分析

2.2.1 依據(jù)E7的DNA序列的亞型分類 采用Mega5.1軟件Neighbor-joining方法對74例HPV-16型樣本的E7的297 bp(nt562～nt858)片段構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示只有亞洲變異型(45例，60.81%)和歐洲變異型(29 例，39.19%)，沒有發(fā)現(xiàn)非洲1型、非洲2型、亞-美型和北美變異型(圖2);這與E6進(jìn)化樹的結(jié)果一致。

2.2.2 E7堿基突變分析 對E7基因突變分析共檢測到13個堿基位點發(fā)生了13種突變，導(dǎo)致了8種氨基酸突變。E7的轉(zhuǎn)換突變(96.72%)遠(yuǎn)大于顛換突變(3.28%)，且同義突變(50.27%)與錯義突變(49.73%)概率基本相同(表1)。堿基突變率最高的是T846C(45例，60.81%)，導(dǎo)致了同義突變;其次是 A647G(44例，59.46%)，導(dǎo)致了N29S氨基酸突變。另外，有4例樣本發(fā)生A646C堿基突變，導(dǎo)致了 N29H氨基酸突變;C749T(36例，48.65%)堿基突變導(dǎo)致了S63F氨基酸突變。1例樣本有T748G堿基突變，導(dǎo)致了S63A氨基酸突變發(fā)生。G666A(21例，28.38%)堿基突變導(dǎo)致了同義突變。此外，1例樣本同時發(fā)生C625T和C627T堿基突變，導(dǎo)致了1例L22F氨基酸突變。氨基酸性質(zhì)發(fā)生改變的突變有(共46例):N29H(4例)、G43E(1例)、P47S(1例)、S63F(36例)、S63A(1例)和 R71C(3例)(表3)。

表1 E6、E7突變類型分析Table 1 The types of E6 and E7 mutations

表2 E6突變情況匯總表(n=74)Table 2 The Mutations of E6 Gene(n=74)

表3 E7突變情況匯總表(n=74)Table 3 The Mutations of E7 Gene(n=74)

2.3 參考株、單位點和多位點突變的分析

對74例樣本E6和E7基因的DNA序列分析發(fā)現(xiàn)與參考株序列相同的病毒株都較少，E6和E7分別為6例占8.1%和2例占2.7%。E6單位點突變(53例，71.6%)超過半數(shù)，多位點突變(15例，20.3%)較少;E7的情況則相反，E7單位點突變較少(15例，20.3%)，多位點突變(57例，77%)超過半數(shù)。對多位點突變的分析發(fā)現(xiàn):74例樣本中，44例樣本同時含有T178G(共44例)、A647G(共44例)、T846C突變(共45例)，只有1例樣本只含有T846C突變例外，并且所有含有T843C突變的樣本(共16例)都含有 T178G、A647G、T846C突變。此外，所有含有C627T突變(共9例)的樣本都含有C749T突變。

3 討論

本研究以 NCBI登錄號為 NC_001526.2的HPV-16型病毒序列為參照，發(fā)現(xiàn)E6的野生型(8.1%)和 E7的野生型(2.7%)都較少，這與對泰國31個樣本分析發(fā)現(xiàn)E6的野生型(13%)較少［5］的結(jié)果一致。在檢測的74例樣本中發(fā)現(xiàn)只有亞洲變異型和歐洲變異亞型，未發(fā)現(xiàn)非洲1、非洲2、亞-美和北美變異亞型，這與從新疆南部［12］和北京人群中得到的病毒樣本［13］的結(jié)果一致。此外，本文中發(fā)現(xiàn)的突變率較高的G666A(21例，28.38%)堿基突變在東北突變率為38.46%，T846C(45例，60.81%)堿基突變的突變率在北京［13］為45.16%，這提示在中國人群中的HPV-16型上這些位點的突變率都較高。

對于E6癌基因，本研究以HPV基因組堿基104位處的ATG為起始密碼子，其共計編碼151個氨基酸［14］，可分為 E6基因 N端(1～79氨基酸)和E6基因C端(80～151氨基酸)兩部分。Q3E、K11R、T22S、D25E、25N 和 L28V 這幾種突變發(fā)生在E6的N端，且Q3E和D25N氨基酸突變改變了氨基酸的性質(zhì)，這可能影響到E6*I(編碼41個氨基酸)的功能，E6*I是E6的一種剪接異構(gòu)體可以抑制E6的作用［15］。R147K突變發(fā)生在E6的C端，位于保守序列143～151內(nèi)，該保守序列SRTRRETQL能與PDZ結(jié)構(gòu)域(最早發(fā)現(xiàn)有此結(jié)構(gòu)域的PSD95、Dlg1和Zo-1三個蛋白的首字母縮寫)相結(jié)合［16-17］，該突變可能會影響E6蛋白與PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，由于E6蛋白可以通過蛋白酶體，將含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白降解，從而影響惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程［18-19］。E6有4個Cysx-x-Cys模塊(分別在 30～33、63～66、103～106和136～139氨基酸位置上)，即潛在的鋅指結(jié)構(gòu)，可以和Zn2+結(jié)合［20］。雖然本研究沒有在鋅指結(jié)構(gòu)處發(fā)生突變，但是在鋅指結(jié)構(gòu)的鏈接處發(fā)現(xiàn)有N58S、L83V、E113D這3處氨基酸突變。

E7蛋白可分為1區(qū)(1～15位氨基酸)、2區(qū)(16～37位氨基酸)和比較保守的3區(qū)(38～98位氨基酸)3個區(qū)域。L22F突變位于E7蛋白2區(qū)的LXCXE模序(22～26位氨基酸)內(nèi)，由于這一模塊可以和pRB(Retinoblastoma Protein)第649～772位氨基酸的口袋結(jié)構(gòu)結(jié)合［21-22］，從而抑制pRB的作用，因此推測可能會影響E7與pRB的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的調(diào)控。而L22F、N29S、N29H突變位于21～34氨基酸處，而該處恰是E7的主要抗原表位所在［23］，可能會影響E7蛋白的免疫原性。G43E、P47S、S63F、S63A、R77C突變都發(fā)生了氨基酸性質(zhì)的改變，且位于E7蛋白的比較保守的3區(qū)(38～98氨基酸)，這些突變也可能會影響E7的功能。3區(qū)含有2個Cys-XX-Cys模塊(58氨基酸處和91氨基酸處)即鋅指結(jié)構(gòu)，可與 Zn2+結(jié)合［24-25］，在鋅指結(jié)構(gòu)的鏈接處發(fā)現(xiàn)S63A、S63F、R77C氨基酸突變，并且這3個氨基酸突變都改變了氨基酸的性質(zhì)，這有可能會影響E7與Zn2+結(jié)合。

本研究發(fā)現(xiàn)很多單個病例的共同突變現(xiàn)象，如44例樣本同時含有 T178G、A647G、T846C突變，這個結(jié)果與熊光武等［13］報道的 A647G和T846C這2種突變都同時存在于同一個樣本中一致。Vaeteewoottacharn.K.發(fā)現(xiàn) E6中 90% 的D25E(176～178 nt)突變與E7的N29S(646～648 nt)一同出現(xiàn)［5］。根據(jù)這些共突變情況，可以從已知的某個突變，來預(yù)測其他有共突變關(guān)系的堿基突變的發(fā)生。此外，日本的研究結(jié)果顯示HPV-16型E6基因的D25E突變和人類白細(xì)胞抗原HLA II的DRB1*1502等位基因相關(guān)，由于HLA II是外源性抗原的遞呈分子，因此推測該突變還可能是引發(fā)侵潤癌和宮頸上皮內(nèi)瘤的發(fā)生最重要的突變［26］。在荷蘭，有 L83V突變的癌癥病人 HLA DRB1*07 頻率也增高(P=0.08)［27］，在瑞典、意大利、捷克也發(fā)現(xiàn)單倍體型DR04-DQ03與L83V突變相關(guān)［28］。因此，推測該突變可能導(dǎo)致癌變的概率增加。所以對HPV-16型病毒的E6、E7基因突變情況的分析顯得尤為重要，分析突變熱點區(qū)域和保守區(qū)域可為研究針對中國人群的宮頸癌疫苗提供一定的線索。

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