李 瑩，李 莉，劉艷玲，李劍梅，王艷華，朱萬(wàn)芹

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110086;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

杏 鮑 菇 (Pleurotus eryngii(DC.et.Fr.)Quèl.)又名刺芹側(cè)耳，因其主要發(fā)生于傘形花科(Umbelliferae)、刺芹屬(Eryngium)、刺芹(Eryngium campestre)枯死的植株根上而得名，是一類分布廣范的木腐生真菌，主要分布于北非、南歐、中亞地區(qū)的高山、草原、沙漠地帶，在我國(guó)新疆、青海、四川等地也有分布［1］。其子實(shí)體含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是近年來(lái)開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌［2］。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)是 Zietkiewicz等基于SSR技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新型的微衛(wèi)星類分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是在SSR序列的3'端或5'端加錨1～4個(gè)隨機(jī)的堿基為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列的簡(jiǎn)單序列間的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增［3］。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)適用于任何物種，可同時(shí)提供多位點(diǎn)信息，并揭示不同位點(diǎn)個(gè)體間變異的信息［4］，該標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳，穩(wěn)定性和可重復(fù)性高，引物具有通用性［5］。由于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠從基因水平揭示菌株間親緣關(guān)系和遺傳差異［6］，并具有簡(jiǎn)單、快速、通用性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)［7］，已在食用菌種質(zhì)資源研究、菌株鑒別和菌株遺傳多樣性等方面得到了廣泛應(yīng)用［8］。本實(shí)驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)20株杏鮑菇菌種進(jìn)行遺傳多樣性分析，可為杏鮑菇遺傳資源的保護(hù)、利用及育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)共收集了20株杏鮑菇菌種(表1)，其中12株是保藏菌種(編號(hào)1～12)，8株是工廠化栽培菌種(編號(hào)13～20)。

表1 20株杏鮑菇菌種Table 1 20 strains of Pleurotus eryngii

1.1.2 PDA綜合培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯200，葡萄糖 20，瓊脂 15，蛋白胨 5，KH2PO43，MgSO41.5，VB11 片。

1.1.3 主要試劑和儀器 電泳儀(DDY-III，北京六一儀器廠)，手動(dòng)型生物安全柜(SPX-safe-1200，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，PCR儀(Applied Biosystems GeneAmpPCR System 2700)，CTAB(天津博迪化工有限公司)，Tris堿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖(北京康為世紀(jì)公司生物科技有限公司)，ISSR引物(北京華大基因)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 將純化的20株杏鮑菇菌種接于PDA綜合培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)。菌絲長(zhǎng)滿后，刮下菌絲放入－20℃冰箱保藏備用。

1.2.2 DNA提取 供試菌種基因組DNA的提取采用 CTAB 法［9］。收集菌絲約 0.2 g，置于 1.5 mL離心管中，加入0.2 g滅菌的石英砂，研磨5～10 min，再加入500 μL 65 ℃預(yù)熱的2 ×CTAB，65℃水浴60 min，每隔5～10 min顛倒1次;加500 μL氯仿 ∶異戊醇(24∶ 1)，顛倒混勻10 min，12000 r/min，4℃離心10 min，取上清，加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，12000 r/min，4℃離心10 min，重復(fù)1次;取上清加入2/3體積的－20℃異丙醇，1/10體積的3 mol/L NaAc(pH 5.2)，混勻，－20℃放置90 min至過(guò)夜;12000 r/min，4℃離心 10 min，出現(xiàn)沉淀，棄液相，加入－20℃的75%乙醇500 μL，上下顛倒洗滌，重復(fù)1次;棄乙醇，晾干，加入 100 μL TE 溶解 DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增 按照DNA序列的排列規(guī)律，加拿大哥倫比亞大學(xué)(University Of British Columbia，UBC)公布了一套(100條)ISSR引物，可針對(duì)研究材料選擇合適的引物［10］。本實(shí)驗(yàn)從UBC提供的引物序列中選擇了22條ISSR引物(表2)，交由華大基因合成。由于可能缺乏同源位點(diǎn)，導(dǎo)致ISSR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物，為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)并得到清晰有效的ISSR分子標(biāo)記，以杏1、杏9為DNA模板，對(duì)22條引物進(jìn)行了初步篩選以及ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。通過(guò)篩選得到擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的ISSR的引物，并對(duì)20株杏鮑菇菌種進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。

25 μL 反應(yīng)體系:10 ×Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，DNA 模板 1.5 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用含有0.1 μL/mL嗅化乙錠(EB)的1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，100 V恒壓30 min，電泳緩沖液為1×Tris-乙酸(TAE)，拍照記錄。

表2 ISSR引物序列(5'～3')Table 2 ISSR primer sequences(5'～3')

1.2.4 ISSR-PCR 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 以“0”和“1”的方式記錄電泳結(jié)果條帶的位置，有條帶賦值“1”，無(wú)條帶賦值“0”，構(gòu)建0/1初始數(shù)據(jù)矩陣，在NTSYSpc 2.10e 軟件中，Similarity-Qualitative data程序的SM計(jì)算品種的遺傳相似系數(shù)，Clustering-SHAN程序中的非加權(quán)組平均法(Unweightedpairgroup method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，通過(guò)Graphics-Tree plot程序構(gòu)建20株杏鮑菇菌種的聚類分析圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析

通過(guò)對(duì)22條引物的初步篩選以及ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，得到 11 條(807、810、818、826、835、836、840(圖1)、841、842、889、891)擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的ISSR引物，每條引物的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以保證準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，每條引物對(duì)不同菌種擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)目不等，在2～9條之間，產(chǎn)物片段大小在100～5000 bp之間。11個(gè)引物共獲得74個(gè)ISSR標(biāo)記位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)51個(gè)，多態(tài)比率為68.92%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出6.73個(gè)位點(diǎn)。

2.2 遺傳相似性分析

菌株間的遺傳相似系數(shù)(geneticsimilarity，GS)是指兩個(gè)體間共同分子標(biāo)記位點(diǎn)占兩個(gè)體總位點(diǎn)的比率，用于衡量?jī)蓚€(gè)體間遺傳差距的大小。結(jié)果顯示(表3)，20株杏鮑菇菌種的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.53～0.95，遺傳差異變化較大，遺傳背景豐富。杏3與DM2、杏6與杏9、杏3壽與杏1(內(nèi))兩兩之間的相似系數(shù)最大為0.95，表明它們之間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近;杏5X-42與杏豐68的相似系數(shù)最小為0.53，說(shuō)明二者的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 ISSR引物840對(duì)20株杏鮑菇菌種的擴(kuò)增圖譜Fig.1 The ISSR profiles of 20 strains of Pleurotus eryngii by primer 840

2.3 ISSR聚類分析

表3 20株杏鮑菇菌種間的相似系數(shù)Table 3 Similarity coefficients among 20 strains of Pleurotus eryngii

電泳圖譜中的每1條擴(kuò)增條帶均代表了引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，同一引物擴(kuò)增的產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為屬于同一位點(diǎn)［11］。結(jié)果顯示(圖2)，20株杏鮑菇菌種的相似系數(shù)在0.62～0.95之間，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.828時(shí)聚為4個(gè)類群，遺傳相似系數(shù)為0.896時(shí)聚為12個(gè)類群，其中杏528壽與其他菌種的親緣系數(shù)最遠(yuǎn)，具有獨(dú)立的遺傳體系。遺傳相似系數(shù)大說(shuō)明二者的遺傳差異小，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.95時(shí)，來(lái)源地不同的杏1(內(nèi))與X杏、杏6與杏9，及來(lái)源地相同的杏3與DM2，兩兩之間親緣關(guān)系較近，可能為同種異名［12］，說(shuō)明ISSR分組與菌株的不同地理來(lái)源之間無(wú)明顯的相關(guān)性，同時(shí)也說(shuō)明菌種命名存在同種異名和同名異種的混亂現(xiàn)象，通過(guò)分子標(biāo)記的方法進(jìn)行分析，為杏鮑菇品種鑒定提供借鑒，有助于規(guī)范杏鮑菇菌種市場(chǎng)，保護(hù)廣大種植戶的利益。

圖2 20株杏鮑菇菌種的ISSR遺傳分析聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster among 20 Pleurotus eryngii strains based on ISSR analysis

3 討論

分子標(biāo)記是以生物個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析，受外界環(huán)境的影響較?。?3］。ISSR分子標(biāo)記是一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，由于其具有快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、基因定位、系統(tǒng)發(fā)育等方面，尤其是在品種鑒定和親緣關(guān)系分析方面，因其具有較高的多態(tài)性，可有效地進(jìn)行種間、種內(nèi)親緣關(guān)系的鑒定。

本實(shí)驗(yàn)從22條引物中篩選出11條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，這11條引物均為二核苷酸的重復(fù)序列，說(shuō)明在選擇ISSR引物時(shí)，應(yīng)以二核苷酸重復(fù)序列為主，少選寡聚三核苷酸、四核苷酸重復(fù)序列的引物。對(duì)20株杏鮑菇菌種進(jìn)行11條引物的ISSR-PCR擴(kuò)增，共獲得74個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其中有 51個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性為68.92%。聚類分析的結(jié)果表明，當(dāng)系數(shù)為0.896時(shí)，20株菌種被分為12個(gè)類群，杏528壽與其他菌株親緣系數(shù)最遠(yuǎn)，具有獨(dú)立的遺傳體系。實(shí)驗(yàn)表明，ISSR分子標(biāo)記能較好地反映杏鮑菇菌種間豐富的遺傳多樣性，進(jìn)一步為ISSR標(biāo)記在杏鮑菇遺傳多樣性上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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