王友升，何欣萌，張 燕，陳玉娟

(北京工商大學食品學院食品質(zhì)量與安全北京實驗室北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048)

雖然化妝品產(chǎn)品設計時普遍采用防腐挑戰(zhàn)試驗，模擬生產(chǎn)、使用過程中受到高強度的微生物污染的潛在可能性，避免由微生物污染造成的損失［1］，但不同類型、不同地區(qū)產(chǎn)品的污染菌及優(yōu)勢菌株并不完全相同。為了解特定產(chǎn)品中的主要腐敗微生物，有針對性地控制微生物污染，常需要從染菌的產(chǎn)品中分離腐敗微生物，并加以鑒定。編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因包含10個可變區(qū)(variable region)和11個恒定區(qū)(constant region)，大小約為1500 bp，所含信息量大且序列高度保守，可變區(qū)因細菌而異，能揭示生物物種特征核酸序列，是細菌種屬鑒定的分子基礎［2-3］。Biolog鑒定系統(tǒng)以四氮唑紫為指示劑，微生物利用或氧化碳源時四氮類染料從無色還原為紫色，從而在鑒定板上形成該微生物的特征代謝模式或指紋，常用于病原菌檢測鑒定等［4］。本研究對某化妝品公司提供的已腐敗變質(zhì)的膏霜樣品進行了微生物的分離純化，獲得了1株具有氯霉素抗性的革蘭陰性菌，并通過16S rRNA基因序列表分析和Biolog系統(tǒng)進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 菌種來自上海某化妝品公司提供的腐敗膏霜樣品。將污染樣品進行梯度稀釋鋪板，取單菌落劃線，分離到1株光滑、整齊的菌落，命名為213#。

1.2 方法

1.2.1 菌落及菌體形態(tài)觀察 將分離菌同時在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基(含氯霉素100 μg/mL)上劃線，分別于37和28℃培養(yǎng)，24、48 h后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)。通過革蘭染色、顯微鏡檢觀察菌體形態(tài)。

1.2.2 基因組 DNA的提取和16S rRNA基因PCR擴增及序列測定 將213#菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。過濾收集菌體，洗滌，CTAB/NaCl法提取基因組DNA作為PCR反應的模板。1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測模板DNA的質(zhì)量。以細菌保守序列16S rRNA基因的通用引物，27f和1492r擴增細菌16S基因序列。其中27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492r:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，50 μL 體系 PCR 擴增:模板 5 μL;10 × 擴增緩沖液 5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)4 μL;引物 (10 μmol/L)各2 μL;Taq DNA 聚合酶 (2.5 U/μL)2 μL;DMSO 3 μL;無菌超純水補足總體積 50 μL。PCR反應程序:94℃預變性3 min，94℃變性1 min，61 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，30 個循環(huán)。然后，72℃延伸10 min，使反應產(chǎn)物擴增充分。取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×溴酚藍上樣緩沖液，在1.0%瓊脂糖凝膠上180 V電泳30 min進行檢測，EB染色后于紫外燈下觀察電泳條帶，送樣測序。

1.2.3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 PCR產(chǎn)物經(jīng)脫鹽純化后，由華大基因公司進行測序。將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索。根據(jù)同源序列搜索結果，提取相關模式菌株的ITS區(qū)基因序列，與實驗菌株序列一起用Clustal X軟件進行匹配排列(align)，用 MEGA3.1軟件按照相關參數(shù)和模型進行進化樹的構建。

1.2.4 碳源代謝指紋圖譜分析 待鑒定菌種用Biolog推薦的BUG培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用GN/GP-IF接種液配制菌懸液，調(diào)節(jié)T=52%，在GN2微孔板中每孔加150 μL菌懸液，保持一定濕度，30℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù)，獲得待鑒定菌的代謝指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 在含氯霉素培養(yǎng)基上的生長情況

213#菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，24 h即可看到明顯的菌落(圖1a)，在含有100 μg/mL氯霉素的孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，也出現(xiàn)明顯生長 (圖1b)。

2.2 基因組提取和PCR擴增

使用 CTAB/NaCl法提取213#菌株的 DNA(圖2A)。以27f和1492r引物對16S rRNA基因保守序列進行擴增，獲得PCR擴增片段在1500 bp左右(圖2B)。

2.3 16S rRNA同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 待鑒定菌株213#在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(a)和孟加拉紅培養(yǎng)基(b)的生長情況Fig.1 Growth of strain 213#cultured on Nutrient agar(a)and Rose bengal medium(100 μg/mL chloramphenicol)(b)for 24 h and 48 h，respectively

圖2 菌株213#的DNA基因組(A)和16S rRNA基因PCR擴增(B)結果Fig.2 Electrophoretogram of total DNA(A)and PCR product(B)of 16S rRNA gene of strain 213#

213#菌株的上述PCR產(chǎn)物測序結果經(jīng)Clustal X軟件和MEGA3.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結果表明，213#菌株與Burkholderia cenocepa-cia、Burkholderia cepacia、Burkholderia anthina(B.andropogonis)、Burkholderia vietnamiensis和 Burkholderi apyrrocinia的同源性均在98.0%以上，其中與Burkholderia cepacia(GQ248182)在同一分枝上，且通過Bootstraps的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率可達100%。因此，可將分離菌株213#確定為洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)。

圖3 以16S rRNA基因序列為分子標記的細菌系統(tǒng)進化樹Fig.3 Analysis of bacteria phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.4 碳源代謝指紋圖譜分析

由表1可以看出，培養(yǎng)24 h后，菌株213#有最適碳源71種，不可利用碳源24種，無可利用碳源;Burkholderia cepacia有最適碳源76種，可利用碳源2種，不可利用碳源17種。二者對95種碳源的代謝指紋圖譜相近，其中利用情況一致的碳源可達75種，包括 D-果糖、L-海藻糖、蔗糖等64種最適碳源，α-環(huán)式糊精、α-D-乳糖、麥芽糖等11種不可利用碳源，表明213#與Burkholderia cepacia有較近的親緣關系。

表1 菌株213#與標準菌株Burkholderia cepacia的碳源代謝指紋圖譜Table 1 Carbon source metabolism analysis of strain 213#and the standard of Burkholderia cepacia

續(xù)表

3 討論

據(jù)報道，洋蔥伯克霍爾德菌原為植物病原菌，因引起洋蔥球莖腐爛而得名，常存在于土壤、水和醫(yī)院環(huán)境中，在動、植物組織中有定殖能力［5］。此外，該菌也可污染醫(yī)院用水及器械，引起特殊人群的獲得性感染［6］。但目前未見自腐敗膏霜類化妝品中分離的報道。研究表明，B.cepacia外膜通透性差，阻礙親水性抗生素通過，此外B.cepacia可產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶［7］，因而對大多數(shù)常用抗生素不敏感。有研究表明，洋蔥伯克霍爾德菌引起的感染耐藥程度較高［8］，尤其是對氨基糖苷類抗菌藥物具有很高的耐藥性，對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素耐藥率均 ＞80.0%［9］。

據(jù)推測，B.cepacia可能通過以下途徑污染化妝品:①B.cepacia具有生物防治、生物降解和促進植物生長等多種功能［10］，因此存在污染化妝品動植物性原料的潛在可能;②在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中染菌，包括生產(chǎn)設備衛(wèi)生、操作人員自身衛(wèi)生等。

［1］施昌松，蔡曉真，張洪廣，等.化妝品中微生物與防腐體系的構建［J］.日用化學品科學，2006，29(12):12-16.

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