魏 東，張毓文

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，上海 200065)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是導(dǎo)致患兒腦癱、癲等神經(jīng)系統(tǒng)疾患，危及新生兒健康，關(guān)系到我國人口素質(zhì)的一個(gè)重要疾病。對(duì)重度HIE病例而言，在臨床上尚無有效的藥物和特殊方法。而干細(xì)胞治療為HIE治療指出了一個(gè)新的方向［1］。窒息對(duì)新生動(dòng)物大腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響已有不少報(bào)道［2-4］?，F(xiàn)已證實(shí)外周血干細(xì)胞在大腦缺血缺氧腦損傷的修復(fù)中有重要作用［5］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)窒息新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(含干細(xì)胞)向神經(jīng)細(xì)胞分化能力及與臨床關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2007年3月至2010年3月同濟(jì)醫(yī)院兒科收治的HIE足月新生兒50例，生后滿72 h進(jìn)行HIE分度評(píng)估，其中重度20例，中度和輕度各10例，所有患兒符合HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。重度HIE患兒生后第14天臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)者10例(無意識(shí)改變、無抽搐、無顱內(nèi)高壓、無肌張力改變、無腦干癥狀)，無好轉(zhuǎn)(具有前述癥狀之一或以上者)或死亡者10例(1周內(nèi)死亡2例，1周后死亡者8例)。同時(shí)期出生的足月新生兒濕肺患兒10例為對(duì)照組，有氣急、吸凹，但經(jīng)皮氧飽和度正常。

1.2 研究方法

1.2.1 分離單個(gè)核細(xì)胞 所有患兒及對(duì)照組均在入院3 h內(nèi)(出生24 h內(nèi))、生后第7天(重度HIE患兒若第7天仍成活)無菌條件下抽取外周血5 ml。以Ficoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，收集單個(gè)核細(xì)胞并用下述增殖培養(yǎng)基配成培養(yǎng)細(xì)胞懸液。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)［7］配制增殖培養(yǎng)基，成分為DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，青霉素(上海新先鋒制藥公司)100 U/ml，鏈霉素(華北制藥公司)100 μg/ml。細(xì)胞以1 ×107/ml的密度每孔 2 ml接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)3 d。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行:增殖培養(yǎng)3 d后吸除培養(yǎng)液，加入無菌PBS輕輕吹打洗滌2次，除去未貼壁的細(xì)胞，取2孔繼續(xù)加入增殖培養(yǎng)基為非誘導(dǎo)分化陰性對(duì)照，另外4孔加入分化培養(yǎng)基，成分為DMEM/F12培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml，全反式維甲酸(Sigma 公司)0.5 μmol/L，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Sigma公司)100 ng/ml，胰島素(Bo-Yun Biotech)25 μg/ml，轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白 (Bo-Yun Biotech)100 μg/ml，肝素(2 ml:12500 u，萬邦醫(yī)藥)2 μg/ml，黃體酮(上海醫(yī)藥有限公司)60 nmol/L。置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d半量換液1次，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，至分化培養(yǎng)第10天，進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。

1.2.4 細(xì)胞的免疫組織化學(xué)鑒定 各培養(yǎng)孔以4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min。用PBS充分洗滌5次。滴加1 g/L的Triton透化15 min，以PBS充分洗滌5次。滴加3%雙氧水浸潤10 min，阻斷細(xì)胞內(nèi)過氧化物歧化酶，以PBS洗滌5次。培養(yǎng)板各孔內(nèi)滴加免疫組織化學(xué)法試劑盒(杭州百通生物技術(shù)有限公司)中的試劑A(正常馬血清)避光常溫孵育45 min封閉抗原，加濃度為5 μg/ml抗-Nestin抗體(R＆D公司)，4℃避光孵育過夜。取出過夜后標(biāo)本，以PBS充分浸泡洗滌5 min×5次，每孔滴加試劑盒中試劑B(生物素標(biāo)記的二抗)，室溫避光孵育60 min，取出后以PBS充分浸泡洗滌5 min×5次。加試劑C(辣根-過氧化物酶復(fù)合物)室溫孵育15 min后PBS充分洗滌5 min×5次。每孔標(biāo)本滴加現(xiàn)配DAB顯色液顯色3～6 min，顯微鏡下觀察，控制顯色時(shí)間、細(xì)胞著色程度。雙蒸水充分沖洗后，顯微鏡下觀察、拍照，每孔計(jì)免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)，并以細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步確認(rèn):至少有兩個(gè)以上的長(zhǎng)突起方計(jì)為陽性。取4孔陽性細(xì)胞數(shù)平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

各組間患者性別、分娩方式、生后時(shí)間、孕周、體質(zhì)量等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

所有重度HIE患者均有氣管插管和機(jī)械通氣。體外細(xì)胞培養(yǎng)10 d后，單個(gè)核細(xì)胞中出現(xiàn)Nestin染色陽性，具有突起的神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞(見圖1)。窒息后輕、中、重度HIE預(yù)后好者、重度HIE預(yù)后差者新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞分化為有神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志Nestin的細(xì)胞數(shù)分別為70.46 ±6.66，73.34 ±6.46，68.99 ±7.85，71.43 ±6.88，與對(duì)照組 71.13 ±7.19比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.506，P=0.732)。重度HIE患兒癥狀好轉(zhuǎn)者外周血單個(gè)核細(xì)胞分化為有神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志Nestin的細(xì)胞數(shù)，第7天(94.50±15.57)較生后 3 h(68.99 ± 7.85)明顯增高(t=4.657，P=0.000)，且高于同時(shí)期癥狀無明顯好轉(zhuǎn)者(69.48 ±5.32，t=4.621，P=0.000;8 例，因?yàn)?2例在1周內(nèi)死亡，第7天數(shù)據(jù)缺失，故從研究中刪除此2 例)，后者與其生后 3 h(72.60 ±7.27)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.465，P=0.165)。

表1 研究對(duì)象一般臨床資料Tab.1 The clinical data of the patients (，n)

表1 研究對(duì)象一般臨床資料Tab.1 The clinical data of the patients (，n)

組別 生后時(shí)間/h 孕周/周 出生體質(zhì)量/g 性別 分娩方式女 剖腹產(chǎn) 陰道分娩對(duì)照組 11.82 ±7.38 38.64 ±1.10 3333.35 ±464.65 6 4 7 3輕度 HIE 組 8.27 ±6.54 39.10 ±1.64 3112.47 ±362.71 5 5 6 4中度 HIE 組 13.79 ±6.88 39.11 ±1.56 3233.18 ±491.89 6 4 5 5重度 HIE 預(yù)后好組 13.25 ±6.53 39.13 ±1.50 3186.28 ±536.04 7 3 4 6重度 HIE 預(yù)后差組 9.78 ±7.5 39.10 ±1.56 3241.14 ±485.28 4 6 3 7 F(χ2) 1.118 0.202 0.294 2.168 3.937 P 0.360 0.936 0.880 0.820 0.494男

圖1 新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為Nestin陽性細(xì)胞Fig.1 PMCs induced to differentiate into Nestin positive cells

3 討 論

HIE仍是目前導(dǎo)致新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要疾病。對(duì)重度病例缺乏有效的治療方法。很多研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧腦損傷時(shí)機(jī)體動(dòng)員內(nèi)源性干細(xì)胞，即大腦中的神經(jīng)干細(xì)胞參與HIE的修復(fù)［1］。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)外周血干細(xì)胞與HIE腦損傷修復(fù)有密切關(guān)系［5］。

臍血單個(gè)核細(xì)胞中含有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的多能干細(xì)胞［8］和間充質(zhì)干細(xì)胞［9］。新生兒外周血中是否有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞?本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，新生兒以及窒息新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞也可分化為具有神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞，即具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能。

窒息對(duì)新生兒外周血干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。缺血缺氧對(duì)大腦中的神經(jīng)干細(xì)胞有明確影響，Zádori等［10］發(fā)現(xiàn)缺氧對(duì)成年小鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外活力和增殖沒有影響，但減弱其體外向神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步分化，缺氧時(shí)小鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞在損傷區(qū)域仍能生存和增殖，但不能分化為神經(jīng)元。Plane等［2］發(fā)現(xiàn)新生大鼠缺血缺氧后促進(jìn)前腦腦室下區(qū)神經(jīng)細(xì)胞生成。Brazel等［3］則發(fā)現(xiàn)新生小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞對(duì)缺氧缺血損傷敏感，易致神經(jīng)前體細(xì)胞耗竭。國內(nèi)尹曉娟等［4］觀察了新生7日齡大鼠HIE病程中NSC隨著HIE病變的變化而發(fā)生著改變，NSC基本上隨病程的延長(zhǎng)而減少。Romanko等［11］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的前體細(xì)胞對(duì)缺氧和缺血敏感，而神經(jīng)干細(xì)胞則對(duì)其有較強(qiáng)的耐受力。本研究未發(fā)現(xiàn)窒息對(duì)新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力有影響。這提示窒息對(duì)中樞神經(jīng)干細(xì)胞和外周血有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能干細(xì)胞的影響是不同的。

本研究發(fā)現(xiàn)，重度HIE患兒恢復(fù)良好者生后第7天外周血單個(gè)核細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)，提示外周血干細(xì)胞在HIE的修復(fù)中有重要作用。外周血干細(xì)胞在窒息時(shí)參與中樞修復(fù)的機(jī)制尚不清楚，可能與直接進(jìn)入中樞分化為神經(jīng)細(xì)胞替代受損腦組織或產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)大腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有關(guān)。臍血干細(xì)胞用于治療新生動(dòng)物HIE的實(shí)驗(yàn)最早報(bào)道于2006年［12］，在7日齡大鼠HIE模型中，缺血缺氧后24 h，由腹腔注入1×107人臍血細(xì)胞，生后21 d發(fā)現(xiàn)治療組運(yùn)動(dòng)功能有較好的改善，且在缺血的腦組織中發(fā)現(xiàn)很多人臍血細(xì)胞。彥小華等［13］用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療新生大鼠缺血缺氧性腦損傷，發(fā)現(xiàn)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以透過血腦屏障，分布在損傷的腦組織周圍，減輕腦水腫和腦損傷。因此，外周血干細(xì)胞在窒息時(shí)可能直接進(jìn)入中樞分化為神經(jīng)細(xì)胞替代受損腦組織，從而起到修復(fù)作用。Yasuhara等［14］發(fā)現(xiàn)，由HIE大鼠靜脈注入1×107人臍血細(xì)胞，可以減輕缺血缺氧所致的運(yùn)動(dòng)平衡和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)缺陷，治療組3 d后腦中神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子明顯升高，提示這些移植的細(xì)胞可能具有旁分泌功能。臍血在體外培養(yǎng)的情況下可以產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子［15-16］，因此，人外周血干細(xì)胞也可能以類似于旁分泌或內(nèi)分泌的方式產(chǎn)生的各種神經(jīng)營養(yǎng)因子參與窒息受損腦組織修復(fù)。

重度HIE新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化潛能與中樞癥狀改善有密切關(guān)系。但外周血單個(gè)核細(xì)胞參與窒息時(shí)中樞損傷保護(hù)的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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