畢婉蓉，邢海林，金彩霞

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分院消化內(nèi)科，上海 200092;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200065;3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心，上海 200092)

慢性肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)的發(fā)病機(jī)制尚不明確。Wnt蛋白是一組分泌型糖蛋白家族，由Wnt基因編碼，其特征是含有保守的半胱氨酸殘基，人 Wnt基因定位于染色體 12q13［1］。Wnt信號通路是一個多作用位點(diǎn)、多環(huán)節(jié)調(diào)控的信號通路，是調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑，與控制胚胎發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)控密切相關(guān)，對于造血干細(xì)胞的自我更新、維持小腸組織的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)骨礦化密度(bone mineral density，BMD)以及脂肪細(xì)胞的分化有著重要意義［2］。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是 HF重要的病理生理過程，Wnt信號通路是否參與其中及如何發(fā)揮作用是本研究的主要內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康雄性小鼠50只，體質(zhì)量(90±10)g。飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。動物合格證號:SCXK(粵)2004A084。動物房室溫20～22℃，光照周期12 h。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，自由飲水，無不良反應(yīng)，進(jìn)食、飲水和活動正常者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)

病理學(xué)檢查是診斷HF的金標(biāo)準(zhǔn)。肝組織切片分別采用H-E染色及VG膠原染色，每張切片隨機(jī)選取4個視野，用圖象分析系統(tǒng)測量VG染色后，計(jì)算膠原面積與總面積的百分比，取平均數(shù)作為判定HF程度的客觀指標(biāo)。由資深病理科醫(yī)師閱片，按下列方法進(jìn)行HF分級。

1級為正常肝組織，無纖維化;2級為某些門靜脈區(qū)域有纖維延伸;3級為門靜脈周圍纖維化，并有短的纖維間隔伸入肝小葉，少數(shù)出現(xiàn)由門靜脈延伸至鄰近門靜脈的纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)欠完整;4級為大多數(shù)門靜脈區(qū)域纖維間隔延伸至鄰近門靜脈和肝的終末小靜脈，肝小葉結(jié)構(gòu)變形，但是沒有出現(xiàn)假小葉;5級彌漫性的假小葉形成［3］。

1.3 試驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備

分析純四氯化碳(CCl4)購自武漢化學(xué)試劑公司;D-Hanks液購自美國Gibco公司;鏈酶蛋白酶E、DNA 酶 I、Triton X-100、0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化液購自上海名臣生物試劑公司;無Ca2+/Mg2+PBS、Nycodenze干粉、DMSO、MTT、FBS、血清替代物(knock out serum replacement，KOSR)、二甲基亞砜、NP-40購自上海滋生科技公司;2 mmol/L Glutamax、20 mmol/L HEPES、SDS、110 mmol/L β-巰基乙醇、Trypsin-EDTA、胎牛血清、明膠購自天津?yàn)蠊?鼠抗α-SMA單克隆抗體、SABC試劑盒、DAB試劑盒購自武漢博士德公司;Wnt3A與Wnt11購自美國Gibbtet公司。

紫外分光光度計(jì)(UV-2100)購自日本島津公司;光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(CH-2)購自日本西門子公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀，組織切片機(jī)購自德國Thermo公司;硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Doc Gel 2000)購自美國 BioRad公司;Image J圖像分析軟件購自美國National Institutes of Health公司。

1.4 方法

1.4.1 動物模型建立及分組 實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，自由飲水，無不良反應(yīng)，進(jìn)食、飲水和活動正常者納入實(shí)驗(yàn)。參照經(jīng)典的CCl4小鼠肝纖維化模型制備方法［4］:除正常對照組外各受試小鼠腹腔注射CCl4和橄欖油按照2∶3比例配成的40%的CCl4油劑(2 ml/kg)，每周2次，共12周，復(fù)制HF模型。實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠食用標(biāo)準(zhǔn)飼料。10只健康雄性小鼠作為正常對照組，20只受試健康成年雄性小鼠分2組各10只，分別腹腔注射Wnt3A與Wnt11各5 ng/ml，每周2次，4周后獲得肝組織。每只小鼠隨機(jī)匯管區(qū)域部分通過免疫熒光顯微鏡下(×20)進(jìn)行量化，α-SMA雙盲法分析。

1.4.2 免疫熒光染色方法 小鼠肝組織標(biāo)本4%多聚甲醛室溫固定，置入30%蔗糖中4℃過夜;冰凍切片機(jī)切10 μm 厚組織標(biāo)本;0.1%Triton-X100、PBS室溫5 min膜通透處理;5% ～10%的山羊/驢血清及5%BSA封閉;一抗孵育，將組織標(biāo)本同時(shí)用將兔抗 E-cad的抗體(Sigma公司，稀釋度1∶2000)和小鼠抗α-SMA的抗體混合在一起加到切片上，覆蓋，4℃過夜;二抗孵育，加入生物素化的羊抗兔IgG(稀釋度1∶200)，37℃孵育30 min，濾紙吸干，避光同時(shí)FITC(綠)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶50)和德克薩斯紅標(biāo)記的驢抗鼠IgG(1∶1000)，37℃孵育30 min，DAPI染色;甘油封片后熒光顯微鏡觀察并拍照，所用 LSCM 型號為 Bio-Rad MRC-1024，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為488 nm。用于圖象采集的顯微鏡物鏡為 Plan-Neofluar 40×油浸鏡，數(shù)值孔徑(NA)為1.3，圖象存為512×512相素類型。根據(jù)需要選擇Zoom范圍。掃描所用的激發(fā)值依據(jù)樣本的不同可以在共聚焦系統(tǒng)提供的梯級值中選擇。

1.4.3 RT-PCR檢測α-SMA、E-cad、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11 mRNA含量取大約300 mg肝組織，加入3 ml TRIzol(Invitrogen)提取總RNA，在紫外分光儀下測定RNA含量，根據(jù)RNA在D260/D280≥1.8及10 g/L瓊脂糖凝膠電泳28 S/18 S RNA條帶比值≥1.5鑒定RNA純度和完整性。取2 μg總RNA為模板，參照TaKaRa公司的 RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件為:95℃ 5 min變性，92℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃ 延伸10 min。取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl在15 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L溴化乙錠)電泳，用美國Pharmacia Master Image紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并用ChmioDox軟件分析圖像，PCR產(chǎn)物量以吸光度×面積表示，與GAPDH比值表示目的基因的相對含量。進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)、多組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料組間頻率比較用Fisher雙側(cè)確切檢驗(yàn);頻率變化趨勢用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體內(nèi)試驗(yàn)HF小鼠肝細(xì)胞Wnt3A與Wnt11的免疫熒光分析

對照組為健康，成年野生型小鼠進(jìn)行染色觀察α-SMA表達(dá)，細(xì)胞用DAPI復(fù)染，白色的箭頭顯示陽性，DAPI將α-SMA細(xì)胞核染成綠色(圖1A)。經(jīng)Wnt3A處理后，在原位(×40)表現(xiàn)出α-SMA染色，Massion染色的E-cad表達(dá)減少(×40)，半定量分析顯示經(jīng)Wnt3A與Wnt11處理后的小鼠肝細(xì)胞α-SMA表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，說明發(fā)生了EMT，見圖1。

2.2 體外試驗(yàn)HF小鼠肝細(xì)胞標(biāo)志物的RT-PCR檢測及形態(tài)學(xué)改變

對照組為正常小鼠肝細(xì)胞，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng);HF組為HF小鼠肝細(xì)胞在血清培養(yǎng)基中培養(yǎng);Wnt組為正常小鼠肝細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基，含有Wnt 5 ng/ml培養(yǎng)2周后，獲得的RNA標(biāo)記的間充質(zhì)半定量 RT-PCR分析收獲 α-SMA、E-cad、Wnt3A、Wnt5A與Wnt11。RT-PCR分析表明，HF組 α-SMA、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11表達(dá)明顯增加，E-cad明顯減少(P ＜0.05);Wnt組 α-SMA、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11表達(dá)明顯增加，E-cad明顯減少(P＜0.05)，見圖2。病理學(xué)顯示更多的間充質(zhì)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)中，經(jīng)歷了EMT，Wnt組顯示了類似HF的小鼠肝細(xì)胞EMT的形態(tài)學(xué)改變，見圖3。

圖1 HF小鼠肝細(xì)胞體內(nèi)Wnt3A與Wnt11的免疫雙熒光表達(dá)及半定量分析Fig.1 Expression of Wnt3A and Wnt11 in liver cells of HF mice by double fluorescence and semi-quantitative analysis

圖2 HF小鼠肝細(xì)胞體外Wnt3A、Wnt5A、Wnt11、E-cad與α-SMA的RT-PCR檢測Fig.2 Detection of Wnt3A，Wnt5A，Wnt11，E-cad and α-SMA expressions in cultured hepatocytes of HF mice by RT-PCR

圖3 HF小鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變Fig.3 Morphological changes in liver cells of HF mice(×10)

3 討 論

當(dāng)Wnt信號通路成分的突變，致其活化過度或失調(diào)時(shí)，便會導(dǎo)致機(jī)體形成腫瘤、發(fā)育異常及器官纖維化。根據(jù)Wnt蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的方式不同，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分為經(jīng)典Wnt信號通路(canonical Wnt signaling pathway，CWSP)和非經(jīng)典的Wnt信號通路(noncanonical Wnt signaling pathway，NWSP)［5］。CWSP(Wnt/β-catenin)通過核內(nèi) β 連接蛋白(βcatenin，β-cat)的累積，激活 Wnt相關(guān)靶基因，CWSP蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3A 和Wnt8等，能夠穩(wěn)定β-cat，從而激活靶基因T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)的轉(zhuǎn)錄［6］。NWSP蛋白包括Wnt4、Wnt5A 和 Wnt11，分為兩條:Wnt/Ca2+通路由Wnt5A和Wnt11激活，通過鈣調(diào)蛋白依賴的激酶Ⅱ(CamkⅡ)、鈣調(diào)蛋白敏感的蛋白磷酸酶(Calcn)和T細(xì)胞核因子NF-AT的作用，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加并激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC);細(xì)胞平面極性通路(Wnt/planar-cell-polarity，PCP)，又稱Wnt/PCP途徑或Wnt/Jun激酶途徑，涉及RhoA和 C-jun激酶(c-jun N-teminal kinase，JNK)，此通路主要調(diào)控細(xì)胞骨架的重排，參與細(xì)胞的變形、遷移以及極性變化等［7］，NWSP可拮抗CWSP。

CWSP調(diào)節(jié)由胞質(zhì)β-cat的磷酸化/降解引起。使之不能再磷酸化β-cat，β-cat在細(xì)胞質(zhì)的水平得到累積，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，結(jié)合到TCF/LEF上形成復(fù)合體，增強(qiáng)靶細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄活性［8］。β-cat進(jìn)入細(xì)胞核并堆積在核內(nèi)，與EMT的發(fā)生密切相關(guān)［9］。Wnt3A可能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞TGF-β2的表達(dá)及促進(jìn)β-cat-Tcf/Lef功能，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而參與HF過程［10］。NWSP不通過β-cat發(fā)揮作用，涉及成員結(jié)合G蛋白、磷脂酶C、PKC、Calan2、JNK、Rho家族、鳥苷三磷酸酶和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放相關(guān)因子。在沒有Wnt信號時(shí)，大部分β-cat與E-cad和細(xì)胞骨架蛋白(actin)結(jié)合維持其穩(wěn)定性，少部分與大腸腺瘤樣蛋白、GSK-3β及Axin結(jié)合形成“降解復(fù)合物”，隨后進(jìn)行泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解，使胞質(zhì)內(nèi)游離的β-cat維持在低水平，不能進(jìn)入核內(nèi)激活作用靶點(diǎn)［11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Massion染色及免疫熒光顯示，Wnt3A與Wnt11處理后的小鼠肝上皮細(xì)胞標(biāo)志(E-cad)減低，肝間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志(α-SMA)升高(P＜0.05)，發(fā)生了EMT;RT-PCR分析表明:HF組與Wnt處理組 α-SMA、Wnt3A、Wnt5A、Wnt11表達(dá)明顯增加，E-cad明顯減少(P＜0.05)。病理學(xué)支持Wnt處理組顯示了類似HF的小鼠肝細(xì)胞EMT的形態(tài)學(xué)改變。本研究表明，在Wnt信號通路在實(shí)驗(yàn)性小鼠肝上皮細(xì)胞中可能通過下調(diào)內(nèi)源的某些自分泌信號抑制因子，而誘導(dǎo)細(xì)胞啟動EMT程序，從而導(dǎo)致HF。EMT標(biāo)志物α-SMA表達(dá)與Wnt/β-cat信號通路有關(guān)。Wnt/β-cat信號激活可能使 Slug、Snail、Twist等表達(dá)增加，降低E-cad并形成EMT。Wnt/β-cat通路對HF有一定促進(jìn)作用。本研究也證實(shí)在小鼠HF過程中，Wnt信號通路誘導(dǎo)激活細(xì)胞EMT程序，說明在上皮細(xì)胞中下調(diào)內(nèi)源的某些自分泌信號抑制因子可誘導(dǎo)細(xì)胞啟動EMT程序，從而導(dǎo)致HF。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt蛋白參與EMT過程時(shí)，β-cat可能并不在核內(nèi)積累產(chǎn)生Wnt信號，包括Wnt5A、Wnt11在內(nèi)的多種Wnt蛋白可能是通過NWSP信號發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)。是否在某些情況下，一種Wnt蛋白的下游信號可以是CWSP信號，也可以是NWSP信號，這使有些EMT的產(chǎn)生可能是通過Wnt二者通路共同誘導(dǎo)的，尚有待于進(jìn)一步研究。

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