李文星，陳 靜，侯文婕，劉月華

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200072;2.同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，上海 200072)

靜電紡絲是一種利用聚合物熔體或溶液，在強(qiáng)電場(chǎng)作用下形成噴射流，從而制備極高比表面積、高孔隙率、相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)狀纖維的技術(shù)［1-2］。利用該技術(shù)所制備的電紡薄膜，在組織工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)控制紡絲溶液成分、空氣濕度和溫度、流速，制備具有不同微觀結(jié)構(gòu)和形貌的靜電紡絲薄膜［3-5］，并以此作為人牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的載體支架［6-9］，進(jìn)行體外符合培養(yǎng)，探討膜片的微觀結(jié)構(gòu)和形貌的改變對(duì)材料細(xì)胞相容性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)相對(duì)分子質(zhì)量1×105，購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司;液體膠原購(gòu)自加拿大Stemcell公司;a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DAPI購(gòu)自上海碧云天公司;MTT細(xì)胞活力和增殖檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海復(fù)蒙基因生物有限公司;Calcein-AM/PI熒光標(biāo)記死活細(xì)胞染色試劑盒，購(gòu)自南京同仁化學(xué)研究所;細(xì)胞培養(yǎng)瓶及孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Quanta 200 FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡;尼康TE2000倒置熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 靜電紡絲制備膜片 通過(guò)控制紡絲溶液成分、空氣濕度和溫度、流速，制成3種靜電紡絲膜片。條件1:PCL按質(zhì)量比8%溶于氯仿，紡絲流速0.7 ml/h，環(huán)境溫度38℃，空氣濕度18%。條件2:紡絲流速1.2 ml/h，環(huán)境溫度35℃，空氣濕度28%。條件3:液體膠原和PCL各按質(zhì)量比4%溶于氯仿，磁力攪拌3 h，超聲振蕩5 h，紡絲流速0.7 ml/h，環(huán)境溫度38℃，空氣濕度18%。紡絲電壓均為15 kV，聚合物溶液帶電噴射成絲后落在鋁箔上，噴絲頭與鋁箔水平距離15 cm。所得材料置于干燥箱內(nèi)干燥2 d，揭下鋁箔上的薄膜即為靜電紡絲膜片。裁剪，雙抗水漂洗，紫外線(xiàn)正反面照射消毒備用。乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.2 PDLCs細(xì)胞培養(yǎng)和接種 人牙齒拔除后立即置于含雙抗(青霉素-鏈霉素)，10%血清的α-MEM培養(yǎng)液中。無(wú)菌條件下用含雙抗PBS緩沖液充分洗滌3次，刮取根中l(wèi)/3的健康牙周膜，將細(xì)碎組織塊移入25 ml培養(yǎng)瓶中，倒置培養(yǎng)瓶于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中2 h后，加入上述培養(yǎng)液中，正置放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3 d換液1次，約l周后有原代細(xì)胞爬出。2.5 g/L胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞，靜置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%時(shí)常規(guī)傳代。第3～5代細(xì)胞留用。將細(xì)胞接種在材料表面，接種密度10萬(wàn)/cm2。

1.2.3 DAPI染色 在PDLCs接種在紡絲膜片的第4、7天，吸干培養(yǎng)液后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min。固定好的細(xì)胞材料復(fù)合體用PBS緩沖液漂洗3次，避光加入配好的DAPI染色液染色20 min。吸干，用PBS緩沖液漂洗6次。用載玻片和蓋玻片制樣，避光冷凍保存。樣本盡快在顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT 將材料裁切為接近96孔孔徑大小，置于孔底，以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種，每孔體積200 μl。同一培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng) 1.5、4、7、9、11 d。每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加 150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(490 nm波長(zhǎng))。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5 Calcein-AM/PI活-死細(xì)胞染色 加 10 μl Calcein-AM儲(chǔ)備液和 15 μl PI儲(chǔ)備液至 5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的終濃度為2 μmol/L，PI的終濃度為 4 μmol/L，避光保存。吸棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗6次。加入染色液，在37℃培養(yǎng)細(xì)胞30 min。用PBS緩沖液洗滌3次。顯微鏡下觀察活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同靜電紡絲膜片形貌的掃描電鏡觀察

在PCL濃度8%，紡絲流速0.7 ml/h，環(huán)境溫度38℃，空氣濕度18%的條件下，制得傳統(tǒng)的細(xì)長(zhǎng)纖維狀膜片。在PCL濃度8%，紡絲流速1.2 ml/h，環(huán)境溫度35℃，空氣濕度28%的條件下，制得液滴狀與纖維狀穿插混合的膜片。在液體膠原和PCL各占比4%的條件下制得圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片，見(jiàn)圖1。

2.2 DAPI染色觀察PDLCs在紡絲膜片的生長(zhǎng)

在細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的第4天，在三種薄膜材料上的細(xì)胞密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而第7天，圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片的細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外兩種薄膜，見(jiàn)圖2。

2.3 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)

在培養(yǎng)第 1.5、4、7、9天，細(xì)胞的數(shù)目不斷增高，而到了第11天，細(xì)胞的數(shù)目開(kāi)始下降。在 第1.5天及第4天，三種薄膜上的細(xì)胞數(shù)目相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而在第7、9、11天，在圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片上的細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外兩種薄膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖 3。

圖1 三種靜電紡絲膜片形貌的掃描電鏡觀察Fig.1 Scan electron microscopic observation of three kinds of electrospinning scaffolds

圖2 DAPI染色觀察PDLCs在紡絲膜片的生長(zhǎng)Fig.2 Observation of PDLCs on three kinds of electrospinning scaffolds by DAPI staining

圖3 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)Fig.3 MTT cell proliferation assay

2.4 Calcein-AM/PI活-死細(xì)胞染色

明場(chǎng)條件下觀察到細(xì)胞材料復(fù)合體。細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的第11天，在圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片上，PDLCs細(xì)胞的活細(xì)胞(綠色)較多，死細(xì)胞(紅色)較少;而另外兩種薄膜上的死細(xì)胞明顯多于圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片，見(jiàn)圖4。

圖4 Calcein-AM/PI活-死細(xì)胞染色Fig.4 Calcein-AM/PI live-dead cell staining

3 討 論

本研究在流速較低、濕度較低、溫度較高的條件下制得傳統(tǒng)的細(xì)長(zhǎng)纖維狀的膜片，而在流速較高、濕度較高、溫度較低的條件下制得液滴狀與纖維狀穿插混合的膜片;在增加膠原，且膠原成分不能完全溶解，而已懸濁狀態(tài)分散在氯仿溶劑中時(shí)，制得圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片。通過(guò)控制紡絲溶液成分、空氣濕度、流速，可以制成不同微觀形貌的靜電紡絲膜片。

在體外培養(yǎng)條件下，PDLCs在3種比例支架上均能生長(zhǎng)。DAPI染色所示細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的第4天，以及MTT檢測(cè)所示，在第1.5、4天，三種薄膜上的細(xì)胞數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，都一致說(shuō)明了三種紡絲的差異對(duì)細(xì)胞早期的黏附貼壁并無(wú)影響。而DAPI染色所示細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的第7天，以及MTT檢測(cè)所示，在第7、9、11天，在圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片上的細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外兩種薄膜，也一致說(shuō)明了三種紡絲的差異對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生了影響。MTT提示，在細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的第11天，細(xì)胞數(shù)目下降，故選擇該時(shí)間點(diǎn)做活-死細(xì)胞染色。結(jié)果顯示，圓盤(pán)狀與纖維狀穿插混合的膜片上的細(xì)胞活性顯著高于另外兩種薄膜上的細(xì)胞。

靜電紡絲膜片是一種在組織工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的支架材料，通過(guò)調(diào)控靜電紡絲的溶液成分［10］、空氣濕度、溫度及流速，可以改變紡絲膜片的微觀結(jié)構(gòu)和形貌，從而影響材料的細(xì)胞相容性。紡絲膜片的微觀形貌和結(jié)構(gòu)的變化，影響了PDLCs細(xì)胞的活性和增殖，其影響機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。而通過(guò)改變材料的微觀結(jié)構(gòu)，改善材料的細(xì)胞相容性，將為紡絲材料的優(yōu)化提供廣闊的空間。

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