韓志海，段蘊(yùn)鈾，姜 毅，王曉陽(yáng)，方庭正，黃 燕

煙霧吸入性急性肺損傷是指在火災(zāi)等煙霧環(huán)境下因吸入有毒氣體導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)發(fā)生病理生理改變，如肺泡壁增厚、肺泡腔及肺泡間隔蛋白滲出、炎癥細(xì)胞聚集、肺水腫，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、低氧血癥、呼吸衰竭，嚴(yán)重者可發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征，病死率高，是呼吸及危重病科治療中的難題，同時(shí)也是戰(zhàn)傷研究的熱點(diǎn)之一[1-2]。

急性肺損傷的動(dòng)物模型大多以動(dòng)脈血氧分壓降低和肺組織病理?yè)p傷為主要標(biāo)準(zhǔn)。因煙霧吸入性肺損傷多發(fā)生于火災(zāi)中而易合并燒傷，且兩者合并傷的病死率更高，所以國(guó)外的動(dòng)物模型中同時(shí)予以煙霧吸入和皮膚的燒傷[3-5]來(lái)造模。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5-7]，予以科學(xué)改進(jìn)，成功制作了大鼠棉花煙霧吸入性急性肺損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料 溫度可調(diào)式鈦合金錫爐(富迪牌，HT-B型，功率150 W，內(nèi)徑50 mm，深度30 mm，廣東宏泰電子五金工具廠);數(shù)顯溫度計(jì)(宏海牌，XMT-280型，北京宏海永昌儀表技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，量程-50～500℃);集煙筒(自制，內(nèi)徑70 mm、高110 mm圓筒，頂端開(kāi)口直徑12 mm接冷卻管，底端敞開(kāi)，距底端5 mm的側(cè)壁等間隔開(kāi)直徑5 mm的3個(gè)孔用于燃燒時(shí)吸入空氣);冷卻管(紫銅管，內(nèi)徑10 mm，壁厚1 mm，長(zhǎng)度500 mm，兩端設(shè)計(jì)接口);風(fēng)扇;棉花(陽(yáng)光純棉牌新疆一級(jí)長(zhǎng)絨棉);電子天平(JD100-3型，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司);分煙管(自制，直徑30 mm、壁厚2 mm、長(zhǎng)500 mm亞克力管，兩端接內(nèi)徑3 mm接頭，一側(cè)管壁等距離開(kāi)2個(gè)孔接內(nèi)徑8 mm接頭);吸煙瓶(自制，內(nèi)徑62 mm、高180 mm圓形塑料瓶，中央剪開(kāi)，瓶口開(kāi)孔接分煙管，瓶身開(kāi)孔接軟管至廢氣袋);廢氣袋(自制，80 cm×90 cm×40 cm收納袋，開(kāi)口處接內(nèi)徑3 mm接頭)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(嘉美生物技術(shù)有限公司)，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;二辛可酸(bidnchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bipec公司;倒置顯微鏡(日本，Nikon公司);酶標(biāo)儀、電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)，Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠共24只，體質(zhì)量150～250 g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)-2012-0004]提供，海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)-2012-0012]飼養(yǎng)，各組大鼠體質(zhì)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條例處置動(dòng)物，按照隨機(jī)化原則將動(dòng)物分組，分為對(duì)照組及3h、6h、24h組，每組6只。

1.3 煙霧吸入 連接好煙霧吸入裝置后，取大鼠2只分別置入吸煙瓶中，錫爐預(yù)熱至300℃恒溫，稱(chēng)取2 g棉花放入錫爐內(nèi)，立即蓋上集煙筒，啟動(dòng)風(fēng)扇，開(kāi)始計(jì)時(shí)2 min，見(jiàn)大鼠足底皮膚逐漸出現(xiàn)櫻紅色至紫紅色，并有躁動(dòng)、呼吸急促、張口呼吸，至出現(xiàn)呼吸深慢、張口喘鳴時(shí)或滿2 min時(shí)限時(shí)，予以停止吸煙;立即敞開(kāi)吸煙瓶口，吸入空氣7 min，可見(jiàn)大鼠呼吸困難表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn)。3h、6h、24h組重復(fù)上述步驟3～5次，至大鼠吸入空氣7 min仍舊昏迷不醒時(shí)結(jié)束。對(duì)照組無(wú)棉花燃燒過(guò)程，重復(fù)上述步驟5次(圖1)。

圖1 大鼠煙霧吸入性肺損傷模型

1.4 血?dú)夥治?大鼠在脫離煙霧環(huán)境后呼吸室內(nèi)空氣，予以皮下注射生理鹽水2 mL，自由活動(dòng)及飲食。3h、6h、24h 組分別在煙霧吸入3、6、24 h 后給予腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，麻醉生效后腹主動(dòng)脈取動(dòng)脈血1.5 mL送檢，查血液pH值、動(dòng)脈血氧分壓(partial pressure of oxygen in arterial，PaO2)、二氧化碳分壓(pressure of carbon dioxide，PaCO2)等指標(biāo)。對(duì)照組大鼠在模擬煙霧吸入24 h后予以行血?dú)夥治觥?/p>

1.5 支氣管肺泡灌洗液ELISA檢測(cè) 抽取動(dòng)脈血?dú)夂蟮拇笫蠓叛滤?，從大鼠胸正中線開(kāi)胸后分離并夾閉氣管，剝離大血管，完整取出全肺，結(jié)扎右主支氣管，取長(zhǎng)50 mm、22 G硅膠管行氣管插管灌注冷無(wú)菌生理鹽水行左肺灌洗，2 mL注入，回收1.5～1.8 mL，1 500 r/min 4 ℃離心10 min，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.6 肺葉處理 分離右肺各葉，右肺上葉、下葉分別置冷凍管內(nèi)，液氮凍存;右肺中葉予以4%多聚甲醛溶液浸泡72 h后石蠟包埋，切片行蘇木素和伊紅染色。

1.7 ELISA法檢測(cè)BALF、右肺下葉肺組織勻漿中炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子水平 取大鼠BALF上清液及右肺下葉肺組織勻漿，采用雙抗體夾心BCA-ELISA法檢測(cè) BALF 中白介素(Interleukin，IL)-1β、IL-8、右肺下葉勻漿中髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxide，MPO)。采用比色法檢測(cè)SD大鼠右肺下葉肺組織勻漿MDA濃度。采用BCA法檢測(cè)SD大鼠BALF中總蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，LSD法進(jìn)行各組間的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 各組間PaO2的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，3h、6h、24h 組大鼠的PaO2均明顯低于對(duì)照組(P＜0.001)，尤其是 3h、6h組PaO2低于60 mmHg，此時(shí)的吸入氧約為21%，計(jì)算氧合指數(shù)低于300 mmHg，符合急性肺損傷的血?dú)庠\斷標(biāo)準(zhǔn)。血液pH值、HCO3-及碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，HbCO)均在煙霧吸入后立即下降，但24 h后基本恢復(fù)正常。而PaCO2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及血?dú)夥治?±s，n=6)

表1 各組大鼠體質(zhì)量及血?dú)夥治?±s，n=6)

注:與對(duì)照組比較，*F 值依次為 17.857、30.666、7.018、28.321，*P 均＜0.001

組別 pH PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) HCO3-(mmol/L) HbCO(%) 體質(zhì)量(g)對(duì)照組 7.339 ± 0.015 97.68 ± 3.44 40.97 ± 4.21 21.83 ± 2.62 0.00 178.43 ± 23.88 3h 組 7.179 ± 0.066* 56.05 ± 10.26* 45.48 ± 12.30 16.65 ± 4.43* 1.58 ± 0.64* 183.82 ± 34.74 6h 組 7.308 ± 0.034 58.22 ± 6.06* 46.08 ± 2.94 22.65 ± 2.42 0.93 ± 0.16* 169.47 ± 14.07 24h 組 7.321 ± 0.037 68.22 ± 11.57* 46.30 ± 5.69 24.60 ± 2.65 0.20 ± 0.09 200.73 ± 30.10

2.2 大鼠BALF及肺組織勻漿中指標(biāo)檢測(cè) BALF中IL-1β和肺組織勻漿中MPO在3h、6h、24h組均明顯高于對(duì)照組。BALF中IL-8、總蛋白定量和肺組織勻漿中MDA濃度在6h、24h組明顯高于對(duì)照組，而3h組較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠BALF及肺組織勻漿中炎癥指標(biāo)檢測(cè)s，n=6)

表2 各組大鼠BALF及肺組織勻漿中炎癥指標(biāo)檢測(cè)s，n=6)

注:與對(duì)照組比較，*F 值依次為 36.24、49.38、52.46、28.06、26.82，*P 均＜0.05

組別 BALF IL-1β(pg/mL) 肺MPO(ng/mL) BALF IL-8(pg/mL) BALF總蛋白(mg/mL) 肺MDA(nmol/mL)對(duì)照組 41.76 ± 6.02 306.64 ± 62.23 201.97 ± 37.34 504.45 ± 170.18 173.02 ± 35.20 3h 組 54.57 ± 2.87* 400.61 ± 65.42* 212.11 ± 25.88 963.41 ± 96.23 231.92 ± 30.26 6h 組 75.06 ± 9.02* 553.67 ± 64.82* 420.53 ± 94.97* 2349.67 ± 521.61* 347.39 ± 41.51*24h 組 75.61 ± 7.44* 647.11 ± 91.79* 903.59 ± 203.40* 3002.69 ± 560.00* 544.72 ± 138.14*

2.3 肺組織大體及病理組織觀察

2.3.1 肺組織大體觀 對(duì)照組大鼠肺組織顏色均勻、淡粉紅色，組織質(zhì)地柔軟、彈性好，未見(jiàn)腫脹、出血及壞死;3h組大鼠肺組織輕度腫脹，粉紅色為主，可見(jiàn)多處斑片狀出血灶;6h組大鼠肺組織見(jiàn)明顯充血、水腫，表面大部分彌漫鮮紅色至深紅色出血，肺葉邊緣尚無(wú)明顯病變;24h組大鼠肺組織極度腫脹，彌漫性充血、出血，肺組織彈性差，肺質(zhì)量明顯增加。見(jiàn)圖2。

2.3.2 肺組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，腔內(nèi)無(wú)滲出，肺泡間隔無(wú)腫脹、均勻一致;3h組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)稍有破壞，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)出血和滲出物，血管擴(kuò)張，肺泡間隔腫脹，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);6h組及24h組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)彌漫性破壞，腔內(nèi)可見(jiàn)透明膜及漏出的紅細(xì)胞，肺泡間隔增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，24h組較6h組病變更加嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。

圖2 肺組織大體觀

3 討論

煙霧吸入可主要?dú)w納為以下3個(gè)致傷因素:一是熱量，吸入的干熱或濕熱空氣直接造成呼吸道黏膜、肺實(shí)質(zhì)的損傷，如導(dǎo)致聲門(mén)水腫可引起窒息[8]。二是缺氧，因缺氧或吸入窒息劑如一氧化碳引起窒息是火災(zāi)中常見(jiàn)的死亡原因;三是顆粒和毒性物質(zhì)，其中直徑小于1 μm的顆?？梢缘竭_(dá)肺泡腔，引起呼吸道黏膜的直接損傷和廣泛的全身中毒反應(yīng)。煙霧吸入激活了熱應(yīng)激、缺氧應(yīng)激、氧化應(yīng)激及基因毒應(yīng)激這些常見(jiàn)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，以產(chǎn)生各種細(xì)胞因子來(lái)對(duì)抗和減輕損害、修復(fù)損傷，維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但在病理情況下細(xì)胞應(yīng)激同樣也是造成繼發(fā)損傷的原因。目前認(rèn)為，顆粒和毒性物質(zhì)是導(dǎo)致煙霧吸入性肺損傷病理生理改變的“罪魁禍?zhǔn)住?，這些物質(zhì)與肺實(shí)質(zhì)發(fā)生交互反應(yīng)介導(dǎo)了炎癥瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致肺水腫、氣道塑型、氣道阻塞、缺氧性肺血管收縮功能喪失和通氣/血流比例失調(diào)。其中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是煙霧吸入性損傷中的2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

煙霧吸入誘發(fā)的急性肺損傷研究中有很多動(dòng)物模型，發(fā)煙物質(zhì)的種類(lèi)不同導(dǎo)致煙霧成分復(fù)雜，如有害氣體芥子氣的致傷、黑火藥燃燒致傷、高分子有機(jī)聚合材料燃燒致傷等，其致傷機(jī)制也各有側(cè)重，因?yàn)闊崃看蟛糠衷诼曢T(mén)上被消耗，極少能夠抵于聲門(mén)或抵于隆突而到達(dá)肺組織，因此在造模中除去了熱量的影響。因煙霧成分的復(fù)雜性，本實(shí)驗(yàn)選擇了常用的棉花燃燒產(chǎn)煙，也部分代表了棉織料的衣服和家紡在火災(zāi)中的燃燒產(chǎn)煙。選擇棉花作為造模的燃燒物也參考了既往的文獻(xiàn)，大鼠吸入棉花燃燒后的煙霧，4 h即可出現(xiàn)肺濕干重比的升高。提示肺水腫，并且肺內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)也比對(duì)照組增高，類(lèi)似人類(lèi)煙霧性肺損傷中的炎癥反應(yīng)[8]。

在評(píng)價(jià)肺損傷時(shí)本研究選擇動(dòng)脈血氧飽和度、肺組織大體及病理切片觀察等直觀的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在煙霧吸入后3 h即有肺氣體交換功能的降低，至24 h仍明顯低于正常水平;同時(shí)肺組織大體及病理切片在煙霧吸入后3 h即出現(xiàn)損傷性表現(xiàn)，并逐漸加重，至24 h時(shí)十分明顯，但此時(shí)動(dòng)脈血氧分壓對(duì)比致傷后3h、6h組有所升高，考慮為動(dòng)脈血中一氧化碳濃度降低減輕了對(duì)氧氣的競(jìng)爭(zhēng)所致。本研究還選擇了BALF中的IL-1β、IL-8、總蛋白和肺組織勻漿中MDA、MPO作為肺損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]。IL-1β為前炎癥因子，在損傷早期由單核巨噬細(xì)胞釋放，能夠引起IL-8的釋放;后者激活中性粒細(xì)胞募集到肺，引發(fā)炎癥反應(yīng)和肺損傷，當(dāng)肺毛細(xì)血管-肺泡膜損傷后，血漿中蛋白釋放到肺泡腔中，引起B(yǎng)ALF中蛋白升高，引起肺水腫及透明膜的形成。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的產(chǎn)物，其升高為活性氧等自由基損傷細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，提示氧化應(yīng)激損傷加劇。MPO主要由中性粒細(xì)胞釋放出來(lái)，其升高反映了炎癥反應(yīng)的程度。在本實(shí)驗(yàn)中上述指標(biāo)均明顯升高，提示氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，與人類(lèi)的煙霧吸入性肺損傷表現(xiàn)[11-12]類(lèi)似，說(shuō)明本煙霧吸入性肺損傷模型成功建立，可以用于評(píng)價(jià)不同干預(yù)措施對(duì)大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷的影響。

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