何書等

【摘要】 目的：建立逆轉(zhuǎn)錄（RT）-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（LAMP），以快速檢測(cè)手足口病最重要的兩種病原體：腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CA16）。方法：收集手足口病患兒咽拭子標(biāo)本93份，針對(duì)EV71和CA16病毒的VP1基因特異性序列8個(gè)區(qū)域各設(shè)計(jì)6條LAMP引物，分別于63 ℃（EV71）、65 ℃（CA16A）擴(kuò)增1 h，日光下觀察結(jié)果，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較檢測(cè)特異性和敏感性。結(jié)果：EV71、CA16的LAMP最低檢測(cè)限均為500拷貝/管，與對(duì)照病毒無交叉反應(yīng)。93份標(biāo)本中，RT-PCR方法檢測(cè)顯示EV71陽(yáng)性44例，CA16陽(yáng)性36例；RT-LAMP方法檢測(cè)顯示EV71陽(yáng)性46例，CA16陽(yáng)性36例，兩種方法間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：應(yīng)用RT-LAMP檢測(cè)手足口病病原體EV71、CA16快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、特異性高，適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)； 腸道病毒71型； 柯薩奇病毒A組16型； 手足口病

【Abstract】 Objective：To rapidly detect pathogens of hand-foot-and-mouth disease （HFMD） by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP），the two most important pathogens：enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus group A type 16 （CA16）.Method：A total of 93 swab specimens were collected from HFMD children.Six primers which recognized 8 distinct regions on the VP1 gene of enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus A16 （CA16） were designed for RT-LAMP assay.The target genes were amplified for 1 hour at isothermal temperatures of 63 ℃ for EV71 and 65 ℃ for CA16，respectively.The sensitivity and specificity of RT-LAMP were compared with fluorescence quantitative PCR using chi-square test measures.Result：The lower limits of EV71 and CA16 detection were both 500 copies/tube by RT-LAMP assay.No cross reaction was shown among other viruses.Of all the 93 swab specimens，46 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by RT-LAMP，while 44 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by quantitative PCR.There were no significant differences between the two measures（P>0.05）.Conclusion：RT-LAMP may be a more rapid，sensitive，specific and economical measure for detection of HFMD pathogens，especially in primary health service.

【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification； Enterovirus 71； Coxsackievirus A16； Hand-foot-and-mouth disease

First-authors address：Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng 475003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.024

手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是以發(fā)熱、口腔潰瘍和皰疹為特征的一種常見的兒童傳染病，可導(dǎo)致心肌炎、無菌性腦脊髓膜炎和腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年全國(guó)手足口病的患病總?cè)藬?shù)達(dá)1 619 706人，死亡509人[3]。腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16，CA16）是HFMD最重要的兩種病原體，尤其是EV71與HFMD的暴發(fā)流行密切相關(guān)，可引起較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，病死率高[4-5]。因此，建立快速、準(zhǔn)確、特異的EV71和CA16病毒檢測(cè)方法十分重要[6]。

目前，RT-PCR（real-time polymerase chain reaction）技術(shù)已成為臨床快速診斷腸道病毒的重要手段，其特點(diǎn)為敏感性高，檢測(cè)迅速，擴(kuò)增產(chǎn)物無需電泳，可直接定量，檢測(cè)系統(tǒng)密閉，不易發(fā)生污染，但需要昂貴的RT-PCR儀，試劑的價(jià)格也較高，故較難在基層推廣應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi在2000年開發(fā)的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)[7]。即建立針對(duì)靶基因8個(gè)特定區(qū)域的6條特異性引物，在恒溫條件下（60～65 ℃），利用鏈置換DNA聚合酶在幾十分鐘內(nèi)快速、高效、特異地完成對(duì)靶DNA序列的擴(kuò)增，目前此技術(shù)已廣泛用于臨床微生物檢測(cè)[8-10]。本研究采用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HFMD病原體EV71和CA16，評(píng)價(jià)其特異性和敏感性，探討在基層醫(yī)療單位中推廣應(yīng)用的前景。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2012年1-10月本院臨床診斷為手足口病的患兒咽拭子標(biāo)本93份。用采樣棉簽拭抹扁桃體和口腔咽后壁，然后將采樣棉簽在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)，將病毒洗下，4 ℃，8000 rpm，5 min。將咽拭液于-80 ℃凍存，用于RT-LAMP和熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒為天根生物公司生產(chǎn)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR試劑盒TAKARA公司生產(chǎn)，Bst DNA聚合酶為NEB公司生產(chǎn)，Betaine為Sigma公司生產(chǎn)，羥基萘酚藍(lán)（HNB）為晶純?cè)噭┯邢薰井a(chǎn)品，CA16、EV71、諾如病毒和輪狀病毒陽(yáng)性核酸購(gòu)自河南省疾病控制中心，CA16、EV71 RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)安公司。

1.3 核酸提取 采用天根生物公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，按照說明書對(duì)臨床樣本進(jìn)行核酸抽提。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè) 將模板逆轉(zhuǎn)錄后，按照操作說明書操作：94 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 建立RT-LAMP

1.5.1 引物設(shè)計(jì) EV71和CA16均以VP1基因作為引物設(shè)計(jì)的靶基因。在序列的保守區(qū)域，利用PE4軟件設(shè)計(jì)引物。引物由上海生工公司合成。

1.5.2 反應(yīng)體系建立與優(yōu)化 設(shè)置不同的dNTPs濃度、內(nèi)外引物濃度比（1：1、1：2、1：4、1：8、1：10）、Mg2+濃度（2 mM、2.8 mM、3.6 mM、4.4 mM、5.2 mM）、Betaine不同的反應(yīng)時(shí)間（30 min、40 min、50 min、60 min、

70 min）和不同反應(yīng)溫度（60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃），獲得EV71和CA16病毒的最佳反應(yīng)體系為：15 U/L AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1.5μL，8 U/μL BstDNA聚合酶1 μL，10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，0.3 mM/L HNB，0.4 M dNTPs，0.8 μM FIP和BIP，0.2 μM F3和B3，2.8 M MgSO4，1 M Betaine，5 μL模板RNA，加DEPC水至25 μL。充分混勻后，置于水浴鍋內(nèi)1 h，EV71病毒、CA16病毒分別63 ℃、65 ℃。80 ℃，2 min后終止反應(yīng)。

1.5.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

1.5.3.1 肉眼檢測(cè) 根據(jù)日光下反應(yīng)液顏色變化判斷結(jié)果：淺藍(lán)色為陰性，深藍(lán)色為陽(yáng)性。

1.5.3.2 電泳檢測(cè) 將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳約1 h，成像，陽(yáng)性電泳結(jié)果顯示為梯狀條帶；陰性電泳結(jié)果無任何條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩種檢測(cè)方法采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP法檢測(cè)EV71、CA16病毒的特異性 對(duì)臨床樣本的RNA分別進(jìn)行EV71和CA16病毒的RT-LAMP檢測(cè)。EV71檢測(cè)結(jié)果的見圖1，電泳泳道中的樣品從左到右依次是DNA marker、EV71、空白對(duì)照、CA16、輪狀病毒、諾如病毒。只有EV71呈現(xiàn)LAMP典型的梯狀條帶，而其余泳道均無梯狀條帶，因此本研究的RT-LAMP方法對(duì)檢測(cè)EV71方法具有高度特異性。

3 討論

HFMD是我國(guó)兒童高發(fā)傳染病之一，如果能夠在基層醫(yī)療單位確診病情，就可以在第一時(shí)間有效地控制疫情的暴發(fā)與蔓延。熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床檢測(cè)EV71、CA16等病原體的首選方法，但由于受到要求昂貴的設(shè)備儀器等限制，不宜在普通醫(yī)療單位中應(yīng)用[11]。

RT-LAMP方法是利用有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶和兩對(duì)特殊引物，可以在不改變溫度的條件下使引物與模板結(jié)合，并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。本研究建立了EV71和CA16病毒的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，只需在63 ℃或65 ℃的恒溫條件下反應(yīng)60 min，檢測(cè)迅速，耗時(shí)短。

RT-LAMP法可擴(kuò)增出109～1010倍靶序列拷貝，靈敏度相當(dāng)、甚至高于定量熒光PCR方法[12]。LAMP反應(yīng)的結(jié)果判斷須利用不同染料，常見的染料有SYBR Green和羥基萘酚藍(lán)（hydroxy naphthol blue，HNB）等，其中HNB在反應(yīng)前即可加入，不干擾反應(yīng)[13]。本研究的LAMP技術(shù)選擇HNB作為顏色指示劑，其靈敏度與熒光定量PCR相同，達(dá)到500拷貝/管[14]，兩種方法的EV71、CA16檢測(cè)結(jié)果亦無顯著差異。

對(duì)于細(xì)菌類病原體的檢測(cè)，LAMP技術(shù)可直接取患病部位的體液進(jìn)行病原檢測(cè)；反應(yīng)結(jié)束后無需電泳，只需觀察顏色變化來判斷檢測(cè)結(jié)果；整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)管中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單方便。LAMP所需試劑在常溫下比較穩(wěn)定[15]。LAMP反應(yīng)不需要昂貴的PCR儀和試劑，只需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫器，因此具有在基層醫(yī)療單位推廣應(yīng)用的價(jià)值。

本研究建立了HFMD病原體EV71和CA16的單管RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，該方法快速、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)，適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-03-09） （本文編輯：歐麗）