曾光明，劉少恒，牛秋雅，劉云國(guó)，胡新將

(1.湖南大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南大學(xué))，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物，由于具有急慢性毒性作用，甚至可致畸、致癌、致突變[1]，其對(duì)環(huán)境的污染和危害已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的問題．微生物降解PAHs是一種能夠經(jīng)濟(jì)高效地減少PAHs污染的方式[2]．該過程中，微生物分泌的各種胞外和胞內(nèi)酶[3]對(duì)PAHs的開環(huán)降解過程起關(guān)鍵作用．而重金屬會(huì)通過影響微生物的生理活動(dòng)從而影響其酶的分泌過程，也會(huì)通過氧化[4]或者與巰基(-SH)結(jié)合[5]等方式影響酶的結(jié)構(gòu)或活性，從而影響其酶促降解性能．因此，重金屬對(duì)PAHs降解微生物產(chǎn)酶過程及酶促降解過程的影響可能是其影響微生物對(duì)PAHs降解能力的機(jī)制之一.而近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于重金屬影響PAHs生物降解的研究主要集中在其對(duì)降解效率的影響方面[6]，對(duì)于其影響降解效率的機(jī)理卻少有深入研究．

菲(Phenanthrene)是一種PAHs污染環(huán)境中常見的污染物，且其兼具灣區(qū)結(jié)構(gòu)和K區(qū)結(jié)構(gòu)，是致癌PAHs的最小結(jié)構(gòu)單元[7]，常被作為研究PAHs生物降解的模式化物質(zhì)．鎘在污染環(huán)境中分布廣泛，對(duì)人類及環(huán)境危害較大，是一種典型的重金屬污染物．因此，本實(shí)驗(yàn)分別以菲和Cd(II)作為PAHs和重金屬的代表性物質(zhì)，研究Cd(II)對(duì)PAHs高效降解菌Bacillussp. P1在降解菲過程中產(chǎn)酶過程的影響及其對(duì)酶促降解性能的影響，以期為探明Cd(II)對(duì)Bacillussp. P1降解PAHs的影響機(jī)理提供依據(jù)．

1 材料與方法

蛋白的濃度可以表征體系中酶量的多少，測(cè)得含Cd(II)體系和無Cd(II)體系降解菌產(chǎn)生的蛋白濃度的差異可以表征Cd(II)對(duì)降解菌產(chǎn)酶總量的影響．鄰苯二酚2,3-雙加氧酶在細(xì)菌開環(huán)降解菲過程中起關(guān)鍵作用[8]，測(cè)得含Cd(II)體系和無Cd(II)體系降解菌所產(chǎn)生的粗酶液中其酶活的差異可以表征Cd(II)對(duì)降解菌產(chǎn)酶的酶活影響．此外，酶促降解過程中菲降解率的變化是反應(yīng)Cd(II)對(duì)酶促降解過程影響的直接參數(shù)．因此本研究分別從蛋白濃度的變化、粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的變化及酶促降解過程菲降解率的變化3個(gè)方面來考察Cd(II)對(duì)降解菌產(chǎn)酶過程的影響及其對(duì)酶促降解過程的影響．

1.1 菌種來源

從長(zhǎng)期受PAHs污染的污泥中(以PAHs為唯一碳源)篩選出的細(xì)菌Bacillussp. P1[9]，經(jīng)PCR擴(kuò)增其16S rDNA后鑒定，該菌種與Bacillusmalacitensisstrain CECT 5687的同源性高達(dá)100%.

1.2 Cd(II)對(duì)Bacillus sp. P1產(chǎn)酶的影響

1.2.1 胞外酶及胞內(nèi)酶的提取

1)降解菌的培養(yǎng)條件

配制一定體積的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,分裝入幾個(gè)250 mL錐形瓶中,每瓶100 mL,以八層紗布封口,放入高壓滅菌鍋121 °C滅菌30 min.將高壓滅菌后的錐形瓶置于無菌室,紫外燈照射滅菌20 min．在無菌條件下,將保存于斜面中的Bacillussp. P1菌種接種于三角瓶?jī)?nèi)，30 °C，150 r/min條件下好氧振蕩培養(yǎng)48 h．

2)胞外酶、胞內(nèi)酶的提取方式

將降解菌Bacillussp. P1的培養(yǎng)液在4 °C，9 000 r/min條件下離心，收集上清液，即為胞外粗酶液．將分離出的沉淀(菌體)置入0.05 M的磷酸鹽緩沖液中反復(fù)振蕩洗滌，9 000 r/min條件下離心，重復(fù)3次．將收集到的菌體再次置于0.05 M磷酸鹽緩沖液中，制成菌懸液，將其置于0 °C冰水混合浴中，用超聲波破碎儀(XO-1000D，南京舜瑪)間歇破碎細(xì)胞10 min(300 W, 3 s/8 s)．在4 °C下9 000 r/min離心10 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液[10]．

1.2.2 降解菌產(chǎn)酶的SDS-PAGE分析測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法探究在降解菲的過程中Cd(II)對(duì)降解菌Bacillussp. P1所產(chǎn)生的酶的組成和數(shù)量的影響．主要試驗(yàn)方法如下：將12%的分離膠(H2O 3.3 mL，30%丙烯酰胺4.0 mL，1.5 mol/L Tris-HCl 2.5 mL，10%十二烷基苯磺酸鈉0.1 mL，10%過硫酸銨0.1 mL，TEMED 6 μL)灌入兩塊玻璃板間，待凝膠形成后在分離膠上層灌入5%的濃縮膠(H2O 2.7 mL，30%丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol/L Tris-HCl 0.5 mL，10%十二烷基苯磺酸鈉40 μL，10%過硫酸銨40 μL，TEMED 4 μL)，并插入樣品梳．待濃縮膠凝聚后，在電泳槽(Bio-Rad)中倒入電泳緩沖液，取出樣品梳．在每個(gè)凹形凝膠樣品槽中注入10 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker．電泳結(jié)束后，將膠片用考馬斯亮藍(lán)染色，用脫色劑脫色后觀察[11]．使用Gelpro軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析．樣品為分別從在僅含菲(60 mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基((MnSO40.0447 mg/L, ZnSO40.068 6 mg/L, (NH4)6MO7O24·4H2O 0.034 7 mg/L, K2HPO4129.15 mg/L, Na2HPO4167 mg/L, KH2PO443.5 mg/L, NH4Cl 25 mg/L, MgSO413.8 mg/L, CaCl236.4 mg/L, FeCl30.42 mg/L)中培養(yǎng)的菌和從在菲與Cd(II)共存的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(菲濃度為60 m/L；Cd(II)濃度分別為50, 100, 150,200,300 mg/L)中培養(yǎng)的菌中提取出的胞外(胞內(nèi))酶，經(jīng)鹽析和透析后所得．

1.3 Cd(II)對(duì)Bacillus sp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的影響

將Bacillussp. P1分別在僅含菲(60 mg/L)和菲與Cd(II)共存的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(菲濃度為60 m/L；Cd(II)濃度分別為50, 100, 150,200,300 mg/L)培養(yǎng)，3 d后提取粗酶液．在375 nm (UV 2550，SHIMADZU)波長(zhǎng)下測(cè)定鄰苯二酚2,3-雙加氧酶活性．每個(gè)測(cè)試樣品中含2.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 M)，0.4 mL 鄰苯二酚(20 μM)及0.2 mL粗酶液[12]．定義每分鐘1 μmol底物轉(zhuǎn)化所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U．

1.4 Cd(II)對(duì)酶促降解菲的影響

pH及溫度均是影響酶促降解過程的重要因素．過酸或過堿的環(huán)境都會(huì)影響酶促降解性能．溫度過高或者過低也會(huì)影響酶促反應(yīng)的活化能及酶蛋白的結(jié)構(gòu)．本實(shí)驗(yàn)首先確定了酶促降解的較佳pH及溫度條件，在上述條件下探究Cd(II)對(duì)酶促降解菲的影響．pH對(duì)酶促降解菲影響的試驗(yàn)方法如下：取系列反應(yīng)瓶，分別加入20 mL超純水，同時(shí)加入菲，使其在瓶中含量均為25 mg/L．用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0．向每個(gè)瓶中加入2 mL粗酶液，在30 ℃下振蕩反應(yīng)30 min后取出．將樣品用正己烷萃取3次，合并萃取液，用紫外分光光度計(jì)在254 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菲的吸光度，計(jì)算其降解率[13]．同時(shí)設(shè)置加入高溫滅活酶的對(duì)照組．

溫度對(duì)酶促降解菲影響的試驗(yàn)方法如下：取系列反應(yīng)瓶，分別加入20 mL超純水，同時(shí)加入菲使得其在瓶中含量均為25 mg/L．向每個(gè)瓶中加入2 mL粗酶液，分別將其置于25，30，37及45 °C的環(huán)境中，振蕩反應(yīng)30 min后取出，通過前述同樣的方法萃取、測(cè)定、計(jì)算菲的降解率．

Cd(II)濃度對(duì)菲酶促降解影響的試驗(yàn)方法如下：取6個(gè)反應(yīng)瓶，分別往其中加入50 mL超純水，同時(shí)加入菲使其在瓶中的含量分別為5 mg/L．向各瓶中(1號(hào)瓶除外)加入Cd(II)，使1～6號(hào)瓶中的Cd(II)濃度分別為0，50，100，150，200，300 mg/L．再分別往各瓶中加入2 mL粗酶液后,調(diào)節(jié)pH及溫度為1.4前述部分所確定的酶促降解的較佳pH及溫度，振蕩反應(yīng)30 min．隨后將瓶中所有試樣分別用正己烷萃取3次，將萃取液在紫外分光光度計(jì)下254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菲的吸光度，計(jì)算其降解率．本研究中所有體系均設(shè)置3個(gè)平行樣．

2 結(jié) 果

2.1 Cd(II)對(duì)Bacillus sp. P1產(chǎn)酶的影響

Cd(II)對(duì)Bacillussp. P1產(chǎn)酶的影響如圖1所示．圖1(A)和圖1(B)分別表示Cd(II)對(duì)Bacillussp. P1產(chǎn)胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白的影響．圖中的a，b，c，d泳道分別表示在0，50，100，150 mg/L Cd(II)濃度下，細(xì)菌在降解菲過程中產(chǎn)生的蛋白的變化．經(jīng)Gelpro軟件分析可知，胞外及胞內(nèi)蛋白的總濃度隨Cd(II)濃度增加而逐漸減小，胞外、胞內(nèi)蛋白條帶總濃度分別由8.37×106，1.54×107降至5.49×106，6.01×106(Gelpro軟件分析值)．胞外、胞內(nèi)蛋白中含鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的33-45 kD蛋白條帶的濃度也依次減小，分別由4.31×105，5.66×106降至2.39×105，4.78×104．此外，胞外蛋白中小分子蛋白(分子量<20 kD)受較高濃度(150 mg/L)Cd(II)影響較大，該區(qū)域條帶幾乎已完全丟失．

圖1 Cd(II)對(duì)Bacillus sp. P1產(chǎn)生的蛋白的影響

2.2 Cd(II)對(duì)Bacillus sp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的影響

Cd(II)對(duì)Bacillussp. P1粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活的影響如圖2所示．Cd(II)對(duì)Bacillussp.P1胞外及胞內(nèi)粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的酶活均有抑制作用，且在Cd(II)濃度為100～300 mg/L范圍內(nèi)，抑制作用均十分顯著(p<0.05)．當(dāng)Cd(II)濃度由0 mg/L增大至300 mg/L，胞外及胞內(nèi)酶中的鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活分別由266.96，886.30 U/mg下降至38.93，290.26 U/mg．

Cd(II)濃度/(mg·L-1)

2.3 Cd(II)對(duì)菲酶促降解過程的影響

在胞外、胞內(nèi)酶酶促降解菲的過程中，隨著pH增大，菲的降解率均呈先增大后減小的趨勢(shì)．當(dāng)pH為7時(shí)，胞外酶對(duì)菲的降解率達(dá)到最大值88.06%；當(dāng)pH為6時(shí)，胞內(nèi)酶對(duì)菲的降解率達(dá)到最大值97.21%．由圖還可以看出，在試驗(yàn)的整個(gè)pH范圍內(nèi)，胞內(nèi)酶酶促降解菲的效率均高于胞外酶酶促降解菲的效率，這表明，相同pH條件下，胞內(nèi)酶酶促降解菲的能力強(qiáng)于胞外酶酶促降解菲的能力．此結(jié)論同時(shí)映證了圖1和圖2所反映的結(jié)果，表明細(xì)菌在降解菲的過程中，其分泌到胞外起作用的酶量少于胞內(nèi)酶酶量．同時(shí)，胞內(nèi)粗酶液中一些關(guān)鍵開環(huán)酶(如鄰苯二酚2,3-雙加氧酶)的酶活大于胞外粗酶液中關(guān)鍵開環(huán)酶的酶活．由此得知，Cd(II)影響粗酶液中酶量的多少及其中關(guān)鍵開環(huán)酶的酶活大小是其對(duì)菲的酶促降解過程產(chǎn)生影響的內(nèi)在機(jī)制．

pH

溫度對(duì)菲酶促降解過程的影響如圖4所示．在37 ℃時(shí)，胞外酶和胞內(nèi)酶的酶促降解能力最強(qiáng)，對(duì)菲的降解率分別為81.81%和99.81%．在一定溫度范圍內(nèi)，酶保持較高降解活性，且酶促降解性能隨溫度的升高而增大．隨溫度增高，酶活性提高；同時(shí)，菲在水中的溶解性也會(huì)增大，使得其與酶的接觸面積增大，提高了其降解率[14]．然而過高的溫度則會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而降低酶的活性，菲的降解率逐漸降低．

溫度/℃

在確定菲酶促降解的較佳溫度和pH的基礎(chǔ)上，研究該條件下重金屬對(duì)菲酶促降解過程的影響．Cd(II)對(duì)胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的影響如圖5所示．由圖可見，在各酶促降解體系中菲的降解率均高于64.58%，而高溫滅活酶對(duì)照組(未在圖中表示)中菲的降解率為2.83%，表明體系中菲減少的主要原因是酶的作用．在胞外和胞內(nèi)酶降解菲的過程中，Cd(II)的出現(xiàn)均抑制了菲的降解，隨著Cd(II)濃度從0 mg/L增大到300 mg/L，菲的降解率分別從79.86% 降至64.59%，87.96%降低至74.83%．且Cd(II)濃度為300 mg/L時(shí)，抑制作用最顯著(p<0.05)．

Cd(II)濃度/(mg·L-1)

3 討 論

由于Cd(II)的作用，降解菌在降解菲過程中產(chǎn)生的胞外和胞內(nèi)酶的濃度和活性均發(fā)生了改變，其中300 mg/L Cd(II)條件下胞內(nèi)酶中關(guān)鍵開環(huán)酶鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活(290.26 U/mg)比不存在Cd(II)條件下的(886.30 U/mg)降低了67.25%．這可能是由于：1)Cd(II)通過阻礙細(xì)胞分裂而抑制了降解菌的生長(zhǎng)，降解菌數(shù)量的降低減少了體系中酶的產(chǎn)生總量[15]．2)Cd(II)影響降解菌的生理生化過程從而影響其酶的產(chǎn)生及酶的組成和活性．有研究表明，Cd(II)能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧基團(tuán)ROS，導(dǎo)致細(xì)胞的過氧化狀態(tài)形成，從而損害細(xì)胞膜[16]；也有研究表明，Cd(II)能穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜表面蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而影響細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[17]．

Cd(II)對(duì)降解菌胞外、胞內(nèi)酶酶促降解菲的過程具有抑制作用，且隨Cd(II)濃度由0 mg/L增大到300 mg/L，抑制作用逐漸增強(qiáng)，胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的降解率分別由79.86%，87.96%降至64.59%，74.83%．酶促降解菲主要是通過形成酶-底物化合物或者通過降低反應(yīng)過程中的活化能來催化菲的開環(huán)從而使之降解[18]．無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的常量金屬(Mg2+和 Ca2+等)會(huì)作為酶活性中心的一個(gè)必需組分，通過形成酶-金屬-底物復(fù)合物來參與催化作用[19]．而重金屬Cd(II)會(huì)與環(huán)境中的這些常量金屬競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合位點(diǎn)從而使得催化作用降低，導(dǎo)致降解性能減弱．同時(shí)，重金屬Cd(II)對(duì)酶產(chǎn)生毒害作用，它們能與蛋白中的巰基(-SH)結(jié)合，從而破壞其結(jié)構(gòu)[20]．

4 結(jié) 論

1)Cd(II)影響降解菌Bacillussp. P1在降解菲過程中酶的產(chǎn)生過程，導(dǎo)致其蛋白的組成、濃度及活性發(fā)生變化；此外，Cd(II)影響降解菌Bacillussp. P1所產(chǎn)生的酶的酶促降解能力．Cd(II)對(duì)降解菌產(chǎn)酶及酶促降解過程的影響是其影響多環(huán)芳烴降解菌降解能力的重要機(jī)制．

2)Cd(II)抑制降解菌的產(chǎn)酶過程．胞外和胞內(nèi)酶的蛋白濃度均在Cd(II)出現(xiàn)后有所降低，且隨著Cd(II)濃度的增加，其對(duì)酶產(chǎn)生的抑制作用逐漸增強(qiáng)．在無Cd(II)條件下和Cd(II)為300 mg/L條件下培養(yǎng)的降解菌胞外(胞內(nèi))粗酶液中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活分別為266.96 U/mg(886.30 U/mg)，38.93 U/mg(290.26 U/mg)．

3)Cd(II)抑制降解菌所產(chǎn)生的酶酶促降解菲的過程，隨Cd(II)濃度從0 mg/L增加到300 mg/L，其酶促降解菲的能力逐漸減弱，胞外和胞內(nèi)酶酶促降解菲的降解率分別由79.86%降至64.59%，由87.96%降低至74.83%．

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