徐 梅 張 蓓 尹鳳玲 成 杰 劉 洋 李 丹 蔣敬庭 吳昌平

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其組織類型繁多，約85%～90%為上皮性卵巢癌。隨著免疫細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，免疫治療(特別是細(xì)胞過繼性免疫治療)已成為繼腫瘤患者手術(shù)、化療、放療后輔助治療的重要手段之一[1]。本研究目的是探討CIK細(xì)胞是否增強(qiáng)化療藥順鉑DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的殺傷活性，為卵巢癌綜合治療新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

①淋巴細(xì)胞分離液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所)；②COBE spectra 型血細(xì)胞分離機(jī)(Gambro BC公司)；③流式細(xì)胞分析儀EPICS XL(美國貝克曼庫爾特公司)；④鼠抗人CD3McAb(美國Antihody Diagnostica Inc公司)；⑤基因重組人IL-2(山東泉港藥業(yè)有限公司)；⑥重組人IFN-γ(上海克隆生物高技術(shù)有限公司)；⑦重組人IL-1α(美國Pepro Tech EC Ltd公司)；⑧鼠抗人CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標(biāo)記抗體，CD3-FITC/CD16CD56-PE雙標(biāo)記抗體，同型對(duì)照IgG1FITC/IgG1PE/IgG1PE-Cy5IgG1FITC/IgG1PE，IgG1

-PE，IgG1-PC5：(美國Beckman Coulter公司，蘇醫(yī)生物基因公司)；⑨ANNEXIN V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司)；⑩順鉑注射液(批號(hào)：130302 江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 效應(yīng)CIK細(xì)胞的制備和免疫表型分析[2]

用淋巴細(xì)胞分離液密度離心提取O型健康者單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，第1天加入IFN-γ(1.5×106U/L)，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后加入CD3 McAb (100 μg/L)、IL-2(5.0×105U/L )和IL-1α(1.0×105U/L)，以后每2～3天添加一次培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)加IL-2(5.0×105U/L)，于培養(yǎng)第1、7、14天收取CIK細(xì)胞，分別加入抗CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標(biāo)抗體和抗CD3-FITC/CD56-PE雙標(biāo)抗體混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞表型變化，測(cè)定CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞百分比。

1.3 卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

SKOV-3細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，凍存于-196℃液氮中，由我院中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于改良RPMI-1640完全培養(yǎng)基。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK培養(yǎng)上清液對(duì)SKOV-3細(xì)胞的凋亡作用

選取培養(yǎng)l4天的CIK細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，1 500r/min，離心5 min，留取CIK細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，以1∶1的比例混合新鮮改良RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞，培養(yǎng)24 h、48 h收集細(xì)胞，以未加CIK培養(yǎng)液上清的SKOV-3細(xì)胞作為對(duì)照組。按照Annexin V-FITC試劑盒說明結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.5 MTT法測(cè)定CIK細(xì)胞和DDP對(duì)SKOV-3細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

取培養(yǎng)第14天收獲的CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞作為靶細(xì)胞。調(diào)整靶細(xì)胞濃度為1.0×105/ml，加入96孔平底培養(yǎng)板，100 μl/孔。次日細(xì)胞貼壁后按不同組別給予相應(yīng)處理：A1～4CIK作用組，按效靶比不同(A1組5∶1、A2組10∶1、A3組20∶1、A4組40∶1)加入不同濃度的CIK細(xì)胞100 μl；B1～7DDP作用組分別加入用完全培養(yǎng)基配制的不同濃度DDP100 μl (其作用濃度分別為：B1組0.625、B2組1.25、B3組2.5、B4組5、B5組10、B6組20、B7組40 μg/ml)；C1～2CIK聯(lián)合DDP作用組先給予DDP(濃度2.5 μg/ml)作用4 h后，分別按效靶比為5∶1和10∶1加入不同濃度CIK細(xì)胞。同時(shí)設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞及不同濃度效應(yīng)細(xì)胞做對(duì)照孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2孵箱中分別于培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加MTT 20 μl (5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，平板離心機(jī)1 500 r/min離心10 min，小心棄去上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，輕輕振蕩10 min以溶解形成的色素顆粒，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)λ=492 nm波長處的吸光度(A值)。按下列公式計(jì)算抑制率：抑制率 (%)=[1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞A值)/靶細(xì)胞A值]×100%或抑制率(%)= (1-實(shí)驗(yàn)孔A值/靶細(xì)胞A值)×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞表型分析和擴(kuò)增[2]

CD3+CD56+雙陽性CIK細(xì)胞在第1、7、14天所占比例分別為(0.7±0.4)%、(11.5±0.9)%及(31.6±5.5)%。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，CD3+CD56+雙陽性CIK細(xì)胞表達(dá)的比例逐漸增加，本實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)第14天的CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD3+CD56+細(xì)胞比例達(dá)38.7%，見圖1。說明CIK細(xì)胞可通過體外培養(yǎng)獲得大量增殖。

圖1 培養(yǎng)第14天CD3+CD56+CIK細(xì)胞表型變化

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色后，正常的活細(xì)胞不會(huì)被染色(FITC-/PI-，圖2左下象限)，凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色(FITC+/PI-，圖2右下象限)，凋亡晚期和壞死細(xì)胞會(huì)被Annexin V-FITC和PI雙染(FITC+/ PI+，圖2右上象限)。本實(shí)驗(yàn)組24 h 及48 h凋亡率分別為(12.63±0.95)%和(27.13±2.03)%，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明在一定時(shí)間內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長凋亡率不斷增高。

圖2 SKOV-3細(xì)胞與CIK培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)后凋亡情況

2.3 MTT法檢測(cè)不同因素對(duì)SKOV-3生長抑制情況見

在相同作用時(shí)間時(shí)，CIK、DDP及其聯(lián)合治療各小組間抑制率存在顯著性差異(P<0.05)，除DDP 0.625 μg/ml組24 h和48 h抑制率差異無顯著性(P=0.102)，其余各組不同時(shí)間抑制率存在顯著性差異 (P<0.05)，隨著作用時(shí)間延長，其細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)。聯(lián)合用藥組與單一因素處理組組間比較差異存在顯著性 (P<0.05)。見表1。

3 討論

CIK細(xì)胞是由Schmidt Wolf等在1991年首先報(bào)道。其是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、γ-IFN等)共培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞群。CD3+CD56+細(xì)胞是CIK細(xì)胞中的主要效應(yīng)細(xì)胞，既有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抑瘤活性，又具有NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)，故又稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞[3-4]。CIK細(xì)胞與LAK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞相比具有增殖快、殺瘤活性高及對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感的特點(diǎn)[5]，被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方法。CIK治療已被應(yīng)用于腫瘤患者的臨床治療(如白血病[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]等)并取得較好的殺瘤效果。

研究結(jié)果[2]顯示，起初CD3+CD56+細(xì)胞比例為(0.7±0.4)%，第14、21天分別增為(31.6±5.5)%

表1 CIK或(聯(lián)合)DDP對(duì)SKOV-3細(xì)胞的殺傷作用

注：①A1～4CIK治療組：CIK與SKOV-3效靶比依次為5∶1、10∶1、20∶1、和40∶1；②B1～7DDP治療組：DDP濃度依次為0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/ml；③C1～2聯(lián)合治療組：DDP濃度均為2.5 μg/ml，CIK與SKOV-3效靶比分別為5∶1和10∶1。

和(35.8±9.7)%，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)35～52倍。動(dòng)態(tài)分析其表型特征發(fā)現(xiàn)，第14～21天為CD3+CD56+細(xì)胞高表達(dá)的平臺(tái)期，在此期間可獲得較為理想的效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)一步臨床研究發(fā)現(xiàn)，增加CIK細(xì)胞輸注的頻次可明顯降低胃癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)選擇體

外培養(yǎng)14天的CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)其CD3+CD56+細(xì)胞所占比例達(dá)到38.7%。殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)，24 h和48 h的殺傷率分別為(16.52±2.52)%和(24.20±5.59)%。當(dāng)效靶比增為40∶1時(shí)，其24 h和48 h的殺傷率分別為(53.98±5.02)%和(74.74±6.87)%，說明CIK細(xì)胞對(duì)SKOV-3卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，并且，隨著效靶比增加及作用時(shí)間延長，其細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。順鉑是卵巢癌經(jīng)典的一線化療藥物，本研究中，當(dāng)順鉑濃度為2.5 μg/ml時(shí)，48 h對(duì)SKOV-3的抑制率為(46.04±2.76)%，聯(lián)合5∶1和10∶1 CIK細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后細(xì)胞抑制率分別為(69.87±2.67)%和(80.11±2.73)%。這說明隨著CIK細(xì)胞濃度的增加及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞抑制率明顯增高。常規(guī)化療聯(lián)合CIK治療具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：①與靶細(xì)胞結(jié)合并釋放穿孔素及顆粒酶對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。②產(chǎn)生大量細(xì)胞因子(如γ-IFN，TNF-α，IL-2等)作用于腫瘤細(xì)胞。③調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮間接殺傷作用。研究[10]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者在經(jīng)過CIK細(xì)胞治療后，其外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)比例較治療前明顯降低，說明CIK治療可以在一定程度上提高患者的免疫功能。④誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死。Shan等[11]用Curcumin可提高靶細(xì)胞及CIK細(xì)胞表面Fas-FasL蛋白的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)凋亡作用。另有研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞是通過下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2或上調(diào)促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用CIK培養(yǎng)液上清和SKOV-3細(xì)胞共培養(yǎng)，隨后24 h和48 h凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡和壞死率逐漸增加，說明CIK可產(chǎn)生殺傷因子并通過誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡而發(fā)揮殺傷作用。

卵巢癌位于盆腔，其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有局限于腹腔內(nèi)的特點(diǎn)，自體CIK 細(xì)胞無免疫源性，應(yīng)該比較適合于腹腔灌注治療。CIK治療可為無法手術(shù)又難以耐受放化療的晚期卵巢癌患者提供治療策略。對(duì)延長此類患者生存期、改善其生存質(zhì)量，具有非常重要的意義。

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