曾 瑋 劉孟剛 劉宏鳴 謝 斌 袁 濤 楊俊濤 藍(lán) 翔 陳 平

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病隱匿,預(yù)后差,死亡率高,治療手段有限[1]。而PDAC的發(fā)生發(fā)展過程中，相關(guān)mRNA與ncRNA應(yīng)該是一個(gè)相互調(diào)控的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)過程[2-3]。據(jù)此，本文嘗試分析胰腺癌RNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫內(nèi)多套mRNA與miRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，定義差異表達(dá)的分子，并利用已知的“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-mRNA”構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。定義新的PDAC基因與miRNA。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)一組miRlet-7家族miRNA分子可能在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其到重要作用，可能參與調(diào)控ALDH1A1、ZEB1與HMGA等基因，影響PDAC的發(fā)生與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤mRNA與miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)

PDAC相關(guān)差異表達(dá)mRNA與miRNA數(shù)據(jù)來自于Pancreatic Expression Database(PED)數(shù)據(jù)庫[4]。在數(shù)據(jù)庫內(nèi)篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集共12組，得到差異表達(dá)基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。同時(shí)，篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集共6組，得到差異表達(dá)基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。

1.2 miRNA與mRNA調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)及miRNA疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫

miRNA與mRNA調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)均為文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)數(shù)據(jù)。其中，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控miRNA數(shù)據(jù)來源于transmir數(shù)據(jù)庫[5]。miRNA靶向調(diào)控mRNA數(shù)據(jù)來自miRNAwalk數(shù)據(jù)庫[6]。miRNA與疾病關(guān)系數(shù)據(jù)來源于人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(HMDD)[7]及人類miRNA疾病與生物學(xué)過程數(shù)據(jù)庫(PhenomiR)[8]。已知癌基因數(shù)據(jù)來自CGC(Cancer Gene Census)數(shù)據(jù)庫[9]，共收集488個(gè)已知癌基因。

1.3 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與核心調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)

尋找所有差異RNA分子間存在的調(diào)控關(guān)系，包括“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA”以及“miRNA-mRNA”2種調(diào)控關(guān)系，最后將所有得到的不同分子間的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行整合，形成miRNA-RNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

核心調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)定義：①所有子網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)均為差異表達(dá)mRNA或者miRNA;②子網(wǎng)絡(luò)中轉(zhuǎn)錄因子、miRNA及靶基因至少各存在一個(gè)；③子網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)不得少于5個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因與差異表達(dá)miRNA

分析整理PED數(shù)據(jù)庫中的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，共得到465個(gè)差異表達(dá)的基因。包括392個(gè)上調(diào)基因，73個(gè)下調(diào)基因。差異基因中有82個(gè)為已知癌基因[9]。所有差異表達(dá)基因用biNGO軟件[10]進(jìn)行GOslim富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因大多富集到“細(xì)胞增殖”、“細(xì)胞分化”、“細(xì)胞骨架”及“細(xì)胞死亡”等功能(表1)。相關(guān)功能都與PDAC發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[3]。

表1 差異表達(dá)基因GOslim功能富集結(jié)果

分析miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，得到97個(gè)差異表達(dá)的miRNA。包括87個(gè)上調(diào)的miRNA,10個(gè)下調(diào)的miRNA。97個(gè)miRNA其中有32個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道與PDAC疾病相關(guān)[7-8]。另外部分miRNA有研究表明與其他腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，hsa-mir-125a可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲功能[11]，hsa-miR-222可以影響子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞分化[12]。

2.2 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過transmir數(shù)據(jù)庫[5]，發(fā)現(xiàn)其中有33個(gè)差異表達(dá)的miRNA可被11個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，形成48個(gè)“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA”的調(diào)控關(guān)系。同時(shí)通過miRNAwalk數(shù)據(jù)庫[6]，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)差異miRNA可能調(diào)控了47個(gè)靶基因，形成了126個(gè)“miRNA靶向mRNA”的關(guān)系。

將以上2種調(diào)控關(guān)系整合成一個(gè)包含轉(zhuǎn)錄因子、miRNA及靶基因的整合網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含88個(gè)節(jié)點(diǎn)，涉及174個(gè)調(diào)控關(guān)系。其中差異表達(dá)基因52個(gè)，差異表達(dá)miRNA 36個(gè)。在整合網(wǎng)絡(luò)中，通過遍歷搜索發(fā)現(xiàn)6個(gè)miR-let-7家族(hsa-let-7i、hsa-let-7d、hsa-let-7b、hsa-let-7g、hsa-let-7c、hsa-let-7e)與周圍的分子形成一個(gè)涉及到13個(gè)節(jié)點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)(表2)。其中EGR1、TGFB1及ZEB1為對miRNA有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,ALDH1A1和HMGA2為靶基因。該5個(gè)基因全部屬于已知癌基因[9]；其中ALDH1A1基因目前已經(jīng)被證實(shí)與PDAC的預(yù)后直接相關(guān)，可被作為PDAC預(yù)后分子標(biāo)記[13]。HMGA2也被證實(shí)與PDAC的惡性程度呈顯著正相關(guān)，是PDAC非常重要的標(biāo)記分子[14]。Simone Brabletz等[2]證實(shí)ZEB1可與miR-200家族相互調(diào)控影響PDAC的發(fā)展。這一現(xiàn)象在網(wǎng)絡(luò)中已有所體現(xiàn)。此外，EGR1與TGFB1很早已被證明與PDAC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-let-7家族在胰腺癌組織中呈高表達(dá)[15],然而還未有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-let-7家族在PDAC發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制，miR-let-7家族與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1及EGR1等基因間的調(diào)控關(guān)系及其與PDAC的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，通過miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，miR let-7與上述分子很可能存在調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而影響PDAC。

表2 核心調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)中基因與miRNA的差異表達(dá)情況

3 討論

miRlet-7家族是生物體內(nèi)一組進(jìn)化來源相同的miRNA分子，由于其序列相似，所以在某些情況下，其在生物體內(nèi)參與的功能有很多類似。目前，已有研究討論miRlet-7家族與細(xì)胞分化以及腫瘤的關(guān)系[16-17]，曲杰等[16]通過合成hsa-let-7b轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以明顯降低細(xì)胞的遷移。Kong 等[17]發(fā)現(xiàn)hsa-let-7可以負(fù)向調(diào)控EZH2基因的表達(dá)，進(jìn)而影響前列腺癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域增殖。雖然，Kent等[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)let-7家族在胰腺癌中顯著高表達(dá)，但未深入研究miR let-7家族在胰腺癌中具體分子機(jī)制。本文利用PDAC的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)與miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，尋找定義神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中的核心mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并由此得到miR-let-7家族相關(guān)的“mRNA-miRNA”核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其網(wǎng)絡(luò)中所有其他基因與miRNA目前都已被大量文獻(xiàn)證實(shí)與PDAC的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。此外，部分mRNA-miRNA調(diào)控關(guān)系也已被研究證實(shí)與PDAC相關(guān)。所以可能提示，hsa-let-7家族可以與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1與EGR1等基因相互調(diào)控并影響PDAC的發(fā)生發(fā)展。因此，深入研究miR-let-7家族與上述分子之間的具體調(diào)控機(jī)制，并如何影響PDAC的發(fā)生發(fā)展將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

由于腫瘤發(fā)病機(jī)制的高異質(zhì)性與復(fù)雜性，目前研究積累的成果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解釋PDAC發(fā)病的分子機(jī)制[18]。定義PDAC相關(guān)癌基因與miRNA對研究其發(fā)病機(jī)理和治療診斷具有非常重要意義。我們利用大規(guī)模膠質(zhì)瘤樣本的RNA分子表達(dá)數(shù)據(jù)，代入“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-基因”數(shù)據(jù)，尋找PDAC發(fā)病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。挖掘批量的PDAC相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制與相關(guān)RNA分子。此外，我們未使用算法預(yù)測的miRNA/mRNA調(diào)控關(guān)系，只使用目前文獻(xiàn)報(bào)道過的mRNA/miRNA調(diào)控關(guān)系，提高了miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。我們相信，隨著癌癥基因與ncRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步積累，同時(shí)，伴隨著miRNA與基因之間的調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)的進(jìn)一步增加。通過本文的mRNA/ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析方法，將可以挖掘更多的潛在的腫瘤相關(guān)RNA分子。

[1] Shi J,Wu C.Meta analyses of risk factors for pancreatic cancer in China 〔J〕.Pancreatic Cancer Study,2004,4(3):154-158.

[2] Simone Brabletz,Karolina Bajdak,Simone Meidhof,et al.The ZEB1/miR-200 feedback loop controls Notch signaling in cancer cells〔J〕.EMBO J,2011,30(4):770-782.

[3] Gong X,Qin XL.Evolve of pancreatic cancer’s medicine cure 〔J〕.Chinese Clinical Oncology，2007,12(1):68-74.

[4] Ma W,Yang D,Gu Y,et al.Finding disease-specific coordinated functions by multi-function genes:insight into the coordination mechanisms in diseases〔J〕.Genomics,2009,94(2):94-100.

[5] Wang J,Lu M,Qiu C,et al.TransmiR:a transcription factor-microRNA regulation database〔J〕.Nucleic Acids Res,2010,38(Database issue):D119-122.

[6] Dweep H,Sticht C,Pandey P,et al.miRWalk--database:p-rediction of possible miRNA binding sites by “walking” the genes of three genomes〔J〕.J Biomed inform,2011,44(5):839-847.

[7] Lu M,Zhang Q,Deng M,et al.An analysis of human microRNA and disease associations〔J〕.Plos One,2008,3(10):3420.

[8] Ruepp A,Kowarsch A,Schmidl D,et al.PhenomiR:a kno-wledgebase for microRNA expression in diseases and biological processes〔J〕.Genome Biology,2010,11(1):R6.

[9] Futreal PA,Coin L,Marshall M,et al.A census of human cancer genes〔J〕.Nature Reviews,2004,4(3):177-183.

[10] Maere S,Heymans K,Kuiper M.BiNGO:a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks〔J〕.Bioinformatics,2005,21(16):3448-3449.

[11] 江黎黎，張清富，常繼紅，等.hsa-miR-125a-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲〔J〕.中國肺癌雜志，2009，12(9):951-955.

[12] Qian K,Hu L,Chen H,et al.Hsa-miR-222 is involved in differentiation of endometrial stromal cells in vitro〔J〕.Endocrinology，2009,150(10):4734-4743.

[13] Kahlert C,Bergmann F,Beck J,et al.Low expression of aldehyde dehydrogenase 1A1(ALDH1A1)is a prognostic marker for poor survival in pancreatic cancer〔J〕.BMC Cancer，2011,11(3):275.

[14] Piscuoglio S,Zlobec I,Pallante P,et al.HMGA1 and HMGA2 protein expression correlates with advanced tumour grade and lymph node metastasis in pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Histopathology，2012,60(3):397-404.

[15] Kent OA,Mullendore M,Wentzel EA,et al.A resource for analysis of microRNA expression and function in pancreatic ductal adenocarcinoma cells〔J〕.Cancer Biol Ther，2009,8(21):2013-2024.

[16] 曲 杰，王勝林，呂喜英，等.MiR let-7b 抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞遷移及其機(jī)制〔J〕.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,22(4):328-331.

[17] Kong D,Heath E,Chen W,et al.Loss of let-7 up-regulates EZH2 in prostate cancer consistent with the acquisition of cancer stem cell signatures that are attenuated by BR-DiM〔J〕.PLos One,2012,7(3):33729.

[18] Abramson MA,Jazag A,van der Zee JA,et al.The Molecular Biology of Pancreatic Cancer〔J〕.Gastrointest Cancer Res，2007,1(4Suppl 2):S7-S12.