姜 晶 王彩芹 劉楠楠

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011)

乳腺癌的發(fā)生是因?yàn)樵┗虻募せ詈鸵职┗虻墓δ苁Щ?，其發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的過(guò)程，往往涉及多個(gè)基因的改變〔1，2〕，近年來(lái)隨著對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β下游重要的信號(hào)分子Smad4蛋白研究的不斷深入，其表達(dá)的減少或缺失與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系逐漸引起人們的重視；Smad4被看作多種腫瘤的抑癌基因。本研究探討Smad4在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1資料 我院病理科乳腺腫瘤患者乳腺組織切除標(biāo)本。乳腺癌70例(高分化型28例、低分化型42例)，伴有相應(yīng)的癌周組織61例，乳腺纖維腺瘤52例。均為女性，原發(fā)單側(cè)，年齡28～78〔平均(47.71±10.13)〕歲。病例臨床資料記錄詳細(xì)，且術(shù)前均未做過(guò)化療及放射治療。

1.2試劑 兔抗人Smad4單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。通用SP-9000免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照SP法試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3病理診斷標(biāo)準(zhǔn) 乳腺癌及癌周組織中乳腺增生性病變的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照乳腺增生癥及乳腺癌組織分類標(biāo)準(zhǔn)〔3〕,同時(shí)參考WHO乳腺病理學(xué)分類(WHO分類)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。

1.4免疫組織化學(xué)染色方法 所有乳腺組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、透明、浸蠟及包埋，連續(xù)切片，厚4 μm,HE染色，常規(guī)確診，并留取白片待免疫組織化學(xué)染色。將切片脫蠟水洗后，pH6.0枸櫞酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)10 min(噴氣后2 min)，羊血清封閉15 min，加一抗(1∶100稀釋)4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，次日依次滴加二抗，三抗，均在37℃溫箱內(nèi)孵育20 min，最后DAB顯色，蘇木素染核，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，上述各步驟間均用PBS洗滌切片3次，每次5 min，用已知陽(yáng)性片做對(duì)照，以PBS為一抗做陰性對(duì)照。

1.5結(jié)果判定 Smad4蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色或黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，陽(yáng)性染色定位準(zhǔn)確(其著色明顯高于背景)，每例切片在高倍視野下，選取5個(gè)視野區(qū)，每個(gè)視野區(qū)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)估，并取其平均值。染色結(jié)果判定評(píng)分；陰性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)；10%～50%為弱陽(yáng)性(+)；51%～75%為中度陽(yáng)性()；>75%為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織Smad4陽(yáng)性率與癌周乳腺增生及纖維腺瘤比較 乳腺癌組織Smad4陽(yáng)性率分別與癌旁乳腺增生、乳腺纖維腺瘤比較均存在顯著差異(P=0.002，P=0.034)。見表1。

表1 各組Smad4蛋白表達(dá)狀況

2.2Smad4在相關(guān)乳腺組織中的表達(dá)差異 乳腺癌高分化型Smad4陽(yáng)性表達(dá)17例(60.7%)；低分化型陽(yáng)性表達(dá)24例(57.1%)，兩者比較無(wú)差異性(P=0.766)。

2.3Smad4在相關(guān)乳腺組織中的表達(dá)定位 Smad4蛋白呈棕黃色或黃色顆粒，主要呈灶狀或彌漫性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，部分間質(zhì)細(xì)胞亦有陽(yáng)性表達(dá)。癌組織，癌周組織及纖維腺瘤均有Smad4表達(dá)，但良性病變組織明顯高于癌組織的表達(dá)。見圖1。

圖1 各組Smad4表達(dá)(×400)

3 討 論

Smad4蛋白是TGF-β超家族下游一類非常重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是把TGF-β與其受體相結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)從胞質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的中介分子〔5〕。Smad4由2個(gè)保守的球狀功能域及中間的可變的連接區(qū)構(gòu)成〔6〕。其氨基端區(qū)常被稱為MH1區(qū)，羧基端區(qū)被稱為MH2區(qū)，僅R-Smad和Smad4含有MH1區(qū)。在Smads家族中，只有Smad4為公共介體，Smads所有生物效應(yīng)都是Smad4與任一種Smad蛋白相互作用的結(jié)果〔7，8〕。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad4等組成一個(gè)腫瘤抑制通路，在此過(guò)程中Smad4起著瓶頸作用。在通常狀態(tài)下，Smad4分布在整個(gè)細(xì)胞中，并呈動(dòng)態(tài)狀態(tài)穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，當(dāng)受體激活引起R-Smad磷酸化后，可使R-Smad與Smad4結(jié)合，促進(jìn)R-Smad得以進(jìn)入細(xì)胞核，最終結(jié)合DNA從而作為轉(zhuǎn)錄因子并發(fā)揮作用。

最近越來(lái)越多的研究證實(shí)，Smad4與乳腺癌有密切關(guān)系〔9～11〕。Smad4蛋白表達(dá)的降低可影響TGF-β/Smad4通路中信號(hào)的正常傳遞，最終導(dǎo)致上皮細(xì)胞的過(guò)度增生和分化異常，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

作為TGF-β信號(hào)通路最常見的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，Smad4對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展同樣起抑制作用〔12，13〕。TGF-β1是多功能肽類生長(zhǎng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、移行和凋亡，在抑制腫瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。TGF-β可抑制細(xì)胞的增殖，Smad4表達(dá)量的降低使TGF-β對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制功能減弱，而TGF-β得以由抑癌基因向促癌基因轉(zhuǎn)化〔14〕。Smad4在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)生基因突變時(shí)，阻斷TGF-β1信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TGF-β作用無(wú)反應(yīng)性，限制TGF-β1的腫瘤抑制作用，使乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞發(fā)生癌變，因此Smad4蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的下游中介分子〔15〕。本研究結(jié)果亦提示不典型增生與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)〔16〕。

普通性導(dǎo)管增生(UDH)包括一般性輕度增生,囊性增生，腺病性增生，上皮呈扁平狀，亦可呈柱狀或立方狀；不典型導(dǎo)管增生(ADH)尤其易見于增生性纖維囊性變，既有囊腫形成又有間質(zhì)增生，通常伴有末梢導(dǎo)管和腺泡上皮的增生，上皮增生呈多房，乳頭狀。若導(dǎo)管上皮增生呈現(xiàn)一定的導(dǎo)管原位癌，而新分類稱其為導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變(DIN),但基于學(xué)術(shù)上理解及交流方便，診斷時(shí)乳腺病變?nèi)员Ａ魝鹘y(tǒng)命名。

乳腺纖維腺瘤由增生的纖維間質(zhì)和腺體組成，腺體呈卵圓形，圓形或裂隙狀，腺體導(dǎo)管由柱狀或圓柱形上皮細(xì)胞構(gòu)成，伴有圓形一致的核，間質(zhì)疏松，富含黏多糖。乳腺癌均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDN),癌細(xì)胞突破導(dǎo)管基膜向間質(zhì)浸潤(rùn)，癌細(xì)胞排成巢狀，條索狀或伴有大量腺樣結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞大小形態(tài)各異，多形性較明顯，核分裂像多見。腫瘤間質(zhì)有致密的纖維組織增生，癌細(xì)胞在間質(zhì)內(nèi)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。根據(jù)腺樣結(jié)構(gòu)多少確定為高分化型及低分化型。

乳腺增生性病變是病理形態(tài)多樣的復(fù)雜病變，重要的是應(yīng)注意有無(wú)不典型增生等癌前病變〔14〕。本結(jié)果提示Smad4參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和生物學(xué)行為，表明Smad4可能具有類似乳腺癌抑癌基因的作用。Smad4基因在乳腺導(dǎo)管上皮增生、病變的啟動(dòng)、促進(jìn)、發(fā)展與浸潤(rùn)等階段起著重要作用。乳腺增生是乳腺腫瘤的病理基礎(chǔ)。

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，由多種遺傳和變異產(chǎn)生，是多種異常的癌基因、抑癌基因共同作用的積累〔17〕。雖然新版(2003年)WHO乳腺良性腫瘤組織分類沒有提到乳腺增生性病變這一概念性名稱，但其內(nèi)容涵蓋了乳腺增生性病變：上皮性腫瘤中的導(dǎo)管內(nèi)增生性病變，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀腫瘤，良性上皮增生以及纖維上皮性腫瘤中的纖維腺瘤。

綜上，Smad4基因的失活在乳腺增生、惡變過(guò)程中具有重要意義，即在乳腺增生性病變中Smad4失活則意味著惡變的始動(dòng)。因此，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)乳腺病變組織中的Smad4的表達(dá)，對(duì)深入了解乳腺癌等惡性腫瘤的生物學(xué)行為以及為臨床評(píng)估乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，預(yù)后判斷都具有重要價(jià)值。

4 參考文獻(xiàn)

1Kallioniemi A.Molecular signatures of breast cancer--predicting the future〔J〕.N Engl J Med，2002；347(25):2067-8.

2Al-Mansouri LJ，Alokail MS.Molecular basis of breast cancer〔J〕.Saudi Med J，2006；27(1):9-16.

3中華病理學(xué)雜志編委會(huì).乳腺增生癥及乳腺癌組織性分類〔J〕.中華病理學(xué)雜志，1997；26(6)：325-6.

4Tavassoli FA,Devilee P.WHO classification of tumours pathology genetics tumors of the breast and female genital organs〔M〕.Lyon：IARC press,2003:10.

5Blobe GC，Schiemann WP，Lodish HF.Role of transforming growth factor beta in human disease〔J〕.N Engl J Med，2000;342(18):1350-8.

6Shi Y，Massagué J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus〔J〕.Cell，2003；113(6):685-700.

7Lee PS，Chang C，Liu D，etal.Sumoylation of Smad4，the common Smad mediator of transforming growth factor-beta family signaling〔J〕.J Biol Chem，2003;278 (30):27853-63.

8Chacko BM，Qin BY，Tiwari A,etal.Structural basis of heteromeric smad protein assembly in TGF-beta signaling〔J〕.Mol Cell，2004;15(5):813-23.

9Stuelten CH，Buck MB，Dippon J,etal.Smad4-expression is decreased in breast cancer tissues：a retrospective study〔J〕.BMC Cancer，2006；6:25.

10Pouliot F，Labrie C.Role of Smad1 and Smad4 proteins in the induction of p21WAF1，Cip1 during bone morphogenetic protein-induced growth arrest in human breast cancer cells〔J〕.J Endocrinol，2002；172(1):187-98.

11Hinshelwood RA，Huschtscha LI，Melki J,etal.Concordant epigenetic silencing of transforming growth factor-beta signaling pathway genes occurs early in breast carcinogenesis〔J〕.Cancer Res，2007;67(24):11517-27.

12Kaklamani VG，Baddi L，Liu J,etal.Combined genetic assessment of transforming growth factor-B signaling pathway variants may predict breast cancer risk〔J〕.Cancer Res，2005；65(8):3454-61.

13Kang Y，He W，Tulley S,etal.Breast cancer bone metastasis mediated by the Smad tumor suppressor pathway〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2005；102(39):13909-14.

14陳志明，曹紅十，李榮貴，等.Smad蛋白在乳腺癌和正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009；35(1)：142-5.

15夏立平，劉曉力，陳國(guó)平，等.TGF-β1、TGF-βR1、Smad4在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系〔J〕.海南醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2010；16(6)：693-8.

16黃 焰，趙惠斌，李國(guó)民，等.乳腺良性病變和乳腺癌臨床病理特征及相關(guān)分析〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2007；14(9)：673-5.

17于占江，張 偉，師 巖，等.Smad4與P53在乳腺癌中的表達(dá)與其病理特征的相關(guān)性研究〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011；32(5)：682-3.