尚立群 趙皆 王偉 肖旺 李軍 李學(xué)昌 宋偉安 劉軍強(qiáng) 文鋒 岳彩迎
非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌發(fā)病率的80%,多通過(guò)淋巴、血液及腫瘤浸潤(rùn)等方式進(jìn)行局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究[1]表明,淋巴轉(zhuǎn)移在腫瘤的早期轉(zhuǎn)移中比血行轉(zhuǎn)移更為重要,如何阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移是控制肺癌進(jìn)展的重要課題。肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)的研究[2-7]發(fā)現(xiàn)檢測(cè)肺癌CTC有助于早期診斷及判斷患者預(yù)后,與臨床分期有關(guān),在治療期間定期檢測(cè)并監(jiān)測(cè)CTC的變化,可為評(píng)價(jià)治療方案的敏感性提供依據(jù),有利于開(kāi)展個(gè)體化的治療。通過(guò)CTC檢測(cè)來(lái)早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤已成為腫瘤研究的一個(gè)趨勢(shì)[8]。重組人血管內(nèi)皮抑素是由我國(guó)自主研發(fā)的抗癌新藥,為內(nèi)源性血管生成抑制劑,能夠選擇性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移,達(dá)到抑制腫瘤形成新生血管、切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給途徑、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移的目的[9,10]。重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用已有較多研究與報(bào)道,但其對(duì)腫瘤淋巴管的生成是否存在類(lèi)似的抑制作用,相關(guān)的臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)報(bào)道仍很少見(jiàn)。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了相關(guān)研究,以期探討重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)NSCLC淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移的作用。
1.1 材料
1.1.1 A549肺癌細(xì)胞株 購(gòu)于北京協(xié)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞培養(yǎng)在海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,采用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2,37.5oC恒溫培養(yǎng)箱。
1.1.2 BALB/C裸鼠 5周齡,雌雄各半,體重均為22 g-25 g,購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,裸鼠飼養(yǎng)在解放軍304醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,在環(huán)境控制條件下飼養(yǎng),溫度(22±1)oC,12 h光亮/黑暗環(huán)境,6:00-18:00為光亮周期,18:00-6:00為黑暗周期,并于實(shí)驗(yàn)室自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得海軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.1.3 藥物與試劑 重組人血管內(nèi)皮抑素,由山東先聲麥得津生物制藥有限公司提供;順鉑由山東齊魯制藥有限公司提供;DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶及細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購(gòu)自北京圣??瞪锟萍加邢薰?;鼠抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-C、VEGF-D和VEGF受體(VEGFR)-3單克隆抗體試劑盒購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;鼠抗anti-podoplanin Protein/gp36試劑盒,PV-6000通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB染色試劑盒購(gòu)于上??泼羯锟萍加邢薰?;Miltenyi抗CD45免疫磁珠、LS柱、強(qiáng)磁場(chǎng)磁性細(xì)胞分離架/器購(gòu)于德國(guó)美天旎公司;枸椽酸抗凝血管(ACD)、淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞核熒光染料4,6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚(DAPI)、anti-Napsin A(1:100)和anti-ヰF-1(1:100)熒光抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的建立與分組 于裸鼠右側(cè)腋窩經(jīng)皮下注射濃度為1×107/mL的A549人肺癌細(xì)胞0.2 mL,建立裸鼠異種移植荷瘤模型[11]。注射腫瘤細(xì)胞3周后,選取56只建模成功的荷瘤裸鼠,腫瘤平均直徑為(7±0.4)mm。56只成瘤裸鼠隨機(jī)分為8個(gè)小組(n=7),各組間裸鼠平均體重,腫瘤直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同組雌雄裸鼠分開(kāi)飼養(yǎng)??瞻讓?duì)照組,給予尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL,每天1次;順鉑組,給予尾靜脈注射順鉑20 μg,隔天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素1,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素2 mg/kg,每天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素2,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素4 mg/kg,每天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素3,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素6 mg/kg,每天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素1+順鉑,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素2 mg/kg,每天1次,加順鉑20 μg,隔天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素2+順鉑,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素4 mg/kg,每天1次,加順鉑20 μg,隔天1次;重組人血管內(nèi)皮抑素3+順鉑,給予尾靜脈注射重組人血管內(nèi)皮抑素6 mg/kg,加順鉑20 μg,隔天1次。所有荷瘤裸鼠均連續(xù)給藥2周。
1.2.2 荷瘤裸鼠的處置 給藥結(jié)束后觀察1周,給予水合氯醛麻醉,采用摘眼取血,每只約1 mL,為滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)用血量每組7只動(dòng)物血合并為一組共7 mL,附加實(shí)驗(yàn)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)使采血達(dá)到7組,所采血液置于枸櫞酸抗凝管中保存;取血后處死全部裸鼠并進(jìn)行完整的解剖,包括腫瘤和淋巴結(jié)解剖,以從病理學(xué)方面評(píng)估轉(zhuǎn)移的存在。病理切片由海軍總醫(yī)院病理科制作,并對(duì)腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進(jìn)行HE染色。免疫組織化學(xué)染色診斷北京中杉金橋生物科技有限公司完成,采用免疫酶標(biāo)法對(duì)腫瘤組織進(jìn)行染色,檢測(cè)腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)水平和微淋巴管密度,分別采用抗VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的單克隆抗體和抗鼠podoplanin蛋白抗體作為一抗,PV-6000(辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體)作為二抗,DAB(二氨基聯(lián)苯胺)溶液作為顯色劑,染色成功后組織切片中有VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的部位和微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色。
1.2.3 CTC檢測(cè) 在海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。采用免疫磁珠負(fù)性富集法篩選出外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞[12,13],anti-NapsinA和anti-TTF-1熒光抗染色確定CTC[14],鏡下觀察CTC形態(tài),計(jì)數(shù)各組CTC數(shù)量。CTC檢測(cè)設(shè)備:激光共聚焦采用日本Olympus FV 10i;負(fù)性富集采用德國(guó)Miltenyi Midi MaCS分選器。簡(jiǎn)單的步驟如下:①免疫磁珠負(fù)性富集外周血CTCs,用緩沖液(137 mmol/L NaCl; 2.7 mmol/L KCl; 10 mmol/L Na2HPO4; 2 mmol/L EDTA; 0.5%BSA, pH 7.4)將血樣轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,并定容至50 mL;450 g離心5 min,棄上清;②加入紅細(xì)胞裂解液(155 mmol/L NH4Cl;10 mmol/L KHCO3;0.1 mmol/L EDTA)至50 mL,室溫勻速孵育8 min,450 g離心5 min,棄上清;③重復(fù)紅細(xì)胞裂解步驟,充分裂解殘余的紅細(xì)胞;④加入緩沖液至50 mL,細(xì)胞重懸后顯微鏡下計(jì)數(shù);⑤再次450 g離心5 min,棄上清;⑥按107個(gè)細(xì)胞加入20 μL anti-CD45磁珠的比例,將細(xì)胞與磁珠混勻,并在4oC避光孵育15 min;⑦加入10 mL緩沖液,450 g離心,棄上清;⑧按照每107個(gè)細(xì)胞加入500 μL緩沖液的比例,重懸細(xì)胞;⑨細(xì)胞懸液加入已用緩沖液潤(rùn)洗的LS分離柱,在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下收集流出的細(xì)胞,滴在載玻片上,室溫放置至細(xì)胞干燥;⑩加入2%多聚甲醛固定40 min,PBS洗滌3次,室溫干燥后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。細(xì)胞免疫熒光染色:①細(xì)胞滴片以PBS洗滌5 min,加入0.1%的TritonX-100-PBS孵育5 min;②PBS洗滌3次,每次3 min,以2%的BSA-PBS室溫封閉30 min;③加入anti-Napsin A(1:100)和anti-TTF-1(1:100)熒光抗體室溫孵育1 h;④0.2%BSA-PBS洗滌3次,每次3 min;⑤細(xì)胞滴片在暗處晾干,加入7 μL的DAPI mounting medium封片,蓋玻片固定,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。染色和洗滌均在暗室中操作。
1.3 效果評(píng)定 組織切片免疫組織化學(xué)染色采用免疫酶標(biāo)法,VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白免疫組織化染色陽(yáng)性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的胞質(zhì),呈棕黃色顆粒,VEGFR-3還可見(jiàn)于細(xì)胞間質(zhì)脈管內(nèi)皮細(xì)胞。每例切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%記為0分,1%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分。按染色強(qiáng)度計(jì)分,淡棕褐色記1分,棕褐色記2分,深棕褐色記3分。以?xún)烧呦嗉铀每偡诌M(jìn)行判定,得分≤2分記為表達(dá)陰性,>2分記為表達(dá)陽(yáng)性;由不相同的5位技術(shù)人員分別計(jì)算1次每組的表達(dá)陽(yáng)性率,各組5次計(jì)算結(jié)果的平均值即為該組的表達(dá)陽(yáng)性率。評(píng)估腫瘤組織中淋巴管生成的重要指標(biāo)是組織中的微淋巴管密度,podoplanin蛋白是一種表達(dá)于脈管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白,對(duì)識(shí)別淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的特異性,在NSCLC 組織中,podoplanin蛋白是合適的淋巴管標(biāo)記物,免疫組織化學(xué)染色能使表達(dá)有podoplanin蛋白的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞著色[15,16],再通過(guò)高倍鏡下進(jìn)行微淋巴管計(jì)數(shù),五個(gè)不同視野的平均值作為微淋巴管密度。免疫磁珠負(fù)性富集法篩選出外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,免疫熒光染色確定CTC,鏡下觀察CTC形態(tài),計(jì)數(shù)各組CTC數(shù)量,比較各組差異。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析(One-Way ANOVA),其中包括Levene方差齊性檢驗(yàn),變量之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)和Kendall相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià),相關(guān)系數(shù)大于0.5提示為存在正相關(guān),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 腫瘤組織和淋巴結(jié)病理診斷 各組腫瘤組織和淋巴結(jié)制作成病理切片后進(jìn)行HE染色,鏡下觀察腫瘤組織HE染色結(jié)果符合肺腺癌病理改變,淋巴結(jié)組織染色結(jié)果符合轉(zhuǎn)移癌組織病理改變(圖1)。
2.2 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)和微淋巴管密度 對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色診斷,染色成功后組織切片中有VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的部位和微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色(圖2-圖5)。計(jì)算出各組腫瘤組織VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率和微淋巴管密度,詳見(jiàn)表1。重組人血管內(nèi)皮抑素1、重組人血管內(nèi)皮抑素2、重組人血管內(nèi)皮抑素3及重組人血管內(nèi)皮抑素1+順鉑、重組人血管內(nèi)皮抑素2+順鉑、重組人血管內(nèi)皮抑素3+順鉑各個(gè)組的VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率和微淋巴管密度均明顯低于空白對(duì)照組與順鉑組(P<0.05);3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素組與3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素+順鉑組中,較高濃度重組人血管內(nèi)皮抑素組的VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率和微淋巴管密度低于較低濃度組(P<0.05);3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素組與3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素+順鉑組中,相同重組人血管內(nèi)皮抑素濃度的對(duì)應(yīng)兩組間VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率和微淋巴管密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組微淋巴管密度和VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率之間存在正相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)和Kendall相關(guān)系數(shù)均大于0.5。
2.3 外周血CTC檢測(cè) 免疫磁珠負(fù)性富集法篩選出外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,采用免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察CTC形態(tài)(圖6),計(jì)數(shù)CTC數(shù)目,8組中的7個(gè)組外周血中檢測(cè)出了CTC,詳見(jiàn)表1。重組人血管內(nèi)皮抑素1組、重組人血管內(nèi)皮抑素2組、重組人血管內(nèi)皮抑素3組及重組人血管內(nèi)皮抑素1+順鉑、重組人血管內(nèi)皮抑素2+順鉑、重組人血管內(nèi)皮抑素3+順鉑和順鉑組的CTC數(shù)目明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01),3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素組與3個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑素+順鉑組中,較高濃度重組人血管內(nèi)皮抑素組的CTC數(shù)目低于較低濃度組(P<0.01),重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合順鉑各組的CTC數(shù)目明顯低于單獨(dú)使用順鉑或重組人血管內(nèi)皮抑素(P<0.01)。
圖1 腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)HE染色圖片(×100)。A:腫瘤組織HE染色圖片;B:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)HE染色圖片。鏡下所見(jiàn)腫瘤組織HE染色結(jié)果符合肺腺癌病理改變,淋巴結(jié)組織HE染色結(jié)果符合轉(zhuǎn)移癌組織病理改變,病理診斷為肺腺癌和肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Fig 1 HE staining picture of tumor tissue and metastatic lymph nodes (×100). A: HE staining picture of tumor tissue; B: HE staining picture of metastatic lymph nodes. Endoscopic findings HE staining result of tumor tissue pathological changes in accordance with the pathological changes of lung adenocarcinoma, HE staining results of lymph node tissue were in line with metastatic cancer tissue pathological changes, pathological diagnosis were lung adenocarcinoma and lung cancer lymph node metastasis.
圖2 各組腫瘤組織經(jīng)免疫組化處理微淋巴管著色后的圖片(×400)。A:對(duì)照組;B:順鉑組;C:重組人血管內(nèi)皮抑素1組;D:重組人血管內(nèi)皮抑素2組;E:重組人血管內(nèi)皮抑素3組;F:重組人血管內(nèi)皮抑素1組+順鉑組;G:重組人血管內(nèi)皮抑素2組+順鉑組;H:重組人血管內(nèi)皮抑素3組+順鉑組。Fig 2 Coloring microlymphatic vessel pictures of tumor tissue by IHC in each group (×400). A: Control group; B: Cisplatin group; C: Endostar 1; D:Endostar 2; E: Endostar 3; F: Endostar 1+Cisplatin; G: Endostar 2+Cisplatin; H: Endostar 3+Cisplatin. IHC: immunohistochmeistry.
圖3 各組腫瘤組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色VEGF-C著色后圖片(×200)。A:對(duì)照組;B:順鉑組;C:重組人血管內(nèi)皮抑素1組;D:重組人血管內(nèi)皮抑素2組;E:重組人血管內(nèi)皮抑素3組;F:重組人血管內(nèi)皮抑素1組+順鉑組;G:重組人血管內(nèi)皮抑素2組+順鉑組;H:重組人血管內(nèi)皮抑素3組+順鉑組。Fig 3 Coloring VEGF-C pictures of tumor tissue by IHC staining in each group (×200). A: Control group; B: Cisplatin group; C: Endostar 1; D: Endostar 2;E: Endostar 3; F: Endostar 1+Cisplatin; G: Endostar 2+Cisplatin; H: Endostar 3+Cisplatin. VEGF: vascular endothelial growth factor.
圖4 各組腫瘤組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色VEGF-D著色后圖片(×200)。A:對(duì)照組;B:順鉑組;C:重組人血管內(nèi)皮抑素1組;D:重組人血管內(nèi)皮抑素2組;E:重組人血管內(nèi)皮抑素3組;F:重組人血管內(nèi)皮抑素1組+順鉑組;G:重組人血管內(nèi)皮抑素2組+順鉑組;H:重組人血管內(nèi)皮抑素3組+順鉑組。Fig 4 Coloring VEGF-D pictures of tumor tissue by IHC staining in each group (×200). A: Control group; B: Cisplatin group; C: Endostar 1; D: Endostar 2;E: Endostar 3; F: Endostar 1+Cisplatin; G: Endostar 2+Cisplatin; H: Endostar 3+Cisplatin.
肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快,對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,多數(shù)肺癌患者死于轉(zhuǎn)移,淋巴轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一,部分腫瘤患者在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶的同時(shí),已經(jīng)出現(xiàn)了多處的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17]。早期的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為腫瘤通過(guò)周?chē)延械牧馨凸苻D(zhuǎn)移,隨著研究的深入發(fā)現(xiàn),腫瘤可以誘導(dǎo)淋巴管生成從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移[18,19]。研究[20-22]顯示,VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3與腫瘤淋巴結(jié)生成和轉(zhuǎn)移的關(guān)系極為密切,VEGF-C、VEGF-D是淋巴管生成有力的誘導(dǎo)劑,可通過(guò)結(jié)合并激活特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮的VEGFR-3,介導(dǎo)和啟動(dòng)受體的酪氨酸激酶VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信號(hào)通道,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和特異性淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成和淋巴管擴(kuò)張,增加入侵癌細(xì)胞與淋巴管的接觸面積,促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。迄今為止,有關(guān)血管內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤淋巴管生成抑制作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究并不多見(jiàn)。腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移途徑與血行轉(zhuǎn)移同等重要,因此研究阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移途徑的方法同樣意義重大。
圖5 各組腫瘤組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色VEGFR-3著色后圖片(×200)。A:對(duì)照組;B:順鉑組;C:重組人血管內(nèi)皮抑素1組;D:重組人血管內(nèi)皮抑素2組;E:重組人血管內(nèi)皮抑素3組;F:重組人血管內(nèi)皮抑素1組+順鉑組;G:重組人血管內(nèi)皮抑素2組+順鉑組;H:重組人血管內(nèi)皮抑素3組+順鉑組。Fig 5 Coloring VEGFR-3 pictures of tumor tissue by IHC staining in each group (×200). A: Control group; B: Cisplatin group; C: Endostar1; D: Endostar 2; E: Endostar 3; F: Endostar 1+Cisplatin; G: Endostar 2+Cisplatin; H: Endostar 3+Cisplatin.
圖6 共聚焦顯微鏡下循環(huán)腫瘤細(xì)胞圖片,圖中標(biāo)尺代表10 μm,×1,000。A:循環(huán)腫瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞核熒光染料DAPI染色的圖片;B:循環(huán)腫瘤細(xì)胞經(jīng)anti-NapsinA熒光抗體染色的圖片;C:循環(huán)腫瘤細(xì)胞經(jīng)anti-TTF-1熒光抗體染色的圖片;D:圖6A、B、C整合而成的圖片。Fig 6 Confocal microscopy images of circulating tumor cells, the scale bar represents 10 μm, ×1,000. A was an image of circulating tumor cells dyed by a nucleus fluorescent dye called DAPI; B was an image of circulating tumor cells dyed by anti-NapsinA fluorescent antibody; C was an image of circulating tumor cells dyed by anti-TTF-1 fluorescent antibody; D was an image of circulating tumor cells integrated from Fig 6A-C.
本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)即在于研究重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)肺癌動(dòng)物模型新生淋巴管的抑制作用,可以為血管生成抑制因子如重組人血管內(nèi)皮抑素能否抑制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜合實(shí)驗(yàn)中各組VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率和微淋巴管密度檢測(cè)結(jié)果的差異,以及微淋巴管密度與VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率的相關(guān)性,可以認(rèn)為重組人血管內(nèi)皮抑素確實(shí)具有抑制腫瘤淋巴管生成的作用,通過(guò)抑制腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D的表達(dá),減少組織中VEGFR-3的激活,抑制VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信號(hào)通道,達(dá)到抑制腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移的目的。
Sleeman等[1]認(rèn)為,腫瘤發(fā)生早期進(jìn)入血管的少量腫瘤細(xì)胞會(huì)因?yàn)檠褐械难鲃?dòng)力學(xué)壓力等因素而大部分被破壞,而淋巴管中淋巴液流動(dòng)相對(duì)緩慢,侵入淋巴道的腫瘤細(xì)胞則可以繼續(xù)增殖,先造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,并在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)分化增殖,最終大量的腫瘤細(xì)胞通過(guò)胸導(dǎo)管進(jìn)入血液循環(huán)達(dá)到全身組織器官而形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中各組外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果,提示重組人血管內(nèi)皮抑素與順鉑均能減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目,但作用機(jī)制不同,重組人血管內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制腫瘤血管與淋巴管生成,減少腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán),作用大小與給藥濃度呈正相關(guān);順鉑則是通過(guò)殺死進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,從而減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞。重組人血管內(nèi)皮抑素與順鉑聯(lián)合使用相比單獨(dú)使用重組人血管內(nèi)皮抑素或順鉑能更有效的減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目。采用重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合順鉑,能夠更好地抑制腫瘤通過(guò)血液和淋巴道轉(zhuǎn)移,降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
表1 各組腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)陽(yáng)性率,腫瘤組織微淋巴管密度以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目Tab 1 Positive expression rate of VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-3, microlymphatic vessel density of tumor tissues and CTC number in each group
綜上所述,重組人血管內(nèi)皮抑素抑制NSCLC裸鼠模型淋巴生成的基礎(chǔ)研究,證實(shí)了重組人血管內(nèi)皮抑素可通過(guò)抑制肺癌組織中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)來(lái)抑制新生淋巴管形成,抑制肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移;同時(shí)可以減少腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管進(jìn)入血液循環(huán),與順鉑聯(lián)合使用可更有效降低肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。重組人血管內(nèi)皮抑素抑制NSCLC裸鼠模型淋巴生成的基礎(chǔ)研究,不僅對(duì)NSCLC患者的治療具有指導(dǎo)作用,也為易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的其他惡性腫瘤提供了新的用藥選擇。希望通過(guò)進(jìn)一步的基礎(chǔ)與臨床研究,讓更多的惡性腫瘤患者獲益。