黃耿文，丁 翔，雷 鵬

0 引言

抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(Antibody mediated rejection，AMR)是造成移植腎功能衰竭最主要的原因之一[1-2]。硼替佐米(Bortezomib)是蛋白酶抑制劑的代表性藥物。有報(bào)道顯示，硼替佐米可以抑制腎移植術(shù)后AMR的進(jìn)程，緩解排斥反應(yīng)所造成的移植腎功能損害，但其具體作用機(jī)制目前尚未闡明[3]。為此，筆者應(yīng)用大鼠AMR腎移植模型，研究硼替佐米對腎移植AMR保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 AMR大鼠腎移植模型和實(shí)驗(yàn)分組

1.1.1 移植前致敏 移植前3周預(yù)先取供體Brown-Norway大鼠全血0.5 mL，肝素化后經(jīng)由受體Lewis大鼠陰莖靜脈一次性輸入，以此誘導(dǎo)受體產(chǎn)生供體特異性抗體(Donor specific antibody，DSA)。

1.1.2 移植 MHC完全不相容的供/受體大鼠(Brown-Norway/Lewis)間進(jìn)行腎臟移植，一期移除受體雙側(cè)腎臟。具體手術(shù)方法：動脈吻合采用腹主動脈-腹主動脈端側(cè)吻合，靜脈吻合采用腎靜脈-下腔靜脈端側(cè)吻合，均用10-0 Nylon連續(xù)縫合；泌尿道重建采用輸尿管-輸尿管端端吻合，11-0 Nylon間斷縫合4～5針，不放內(nèi)支撐。所有手術(shù)均由第一作者完成，手術(shù)成功率在90%以上。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組 分3組，每組6例。G1(假手術(shù)組)：受體大鼠僅做開腹關(guān)腹術(shù)；G2(AMR組)：按如上方法致敏和移植；G3(硼替佐米組)：按如上方法致敏和移植，移植手術(shù)前2 d起靜脈注射硼替佐米(0.03 mg/kg，2次/周)直至動物死亡或術(shù)后1周。

1.2 血清標(biāo)本檢測 應(yīng)用IDEXXVetTest化學(xué)分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平。血清DSA檢測采用流式細(xì)胞儀。具體方法：取供體大鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液，與受體血清孵育。然后分別與FITC耦合的山羊或小鼠抗大鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG2c的單克隆抗體冰上反應(yīng)30 min，PBS洗凈，1%福爾馬林固定后流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)檢測受體血清中DSA各亞型水平。

1.3 病理學(xué)檢查 所有石蠟切片經(jīng)H&E染色后由病理科醫(yī)生按Banff標(biāo)準(zhǔn)單盲完成診斷和評分[4-5]。腎組織中C4d采用免疫組織化學(xué)法檢測。一抗為兔抗大鼠C4d多克隆抗體(Hycult Biotech)。C4d陰性記為0分，局灶性陽性表達(dá)記為1分，彌漫性陽性表達(dá)記為2分。移植腎組織中巨噬細(xì)胞采用免疫熒光法檢測。用小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(AbDSerotec)標(biāo)記巨噬細(xì)胞。按顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例分為弱(<30%)、中(30%～60%)和強(qiáng)陽性表達(dá)(>60%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。定量資料多組間比較采用單因素方差分析，半定量等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對腎移植大鼠腎功能的影響 術(shù)后1周硼替佐米組(G3)大鼠血清BUN和CRE分別為(33.17±0.15)和(0.75±0.04)mg/dL，而AMR組大鼠血清BUN和CRE分別為(48.33±0.17)和(1.30±0.05)mg/dL，假手術(shù)組則分別為(20.00±0.10)和(0.37±0.03)mg/dL，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組術(shù)后1周腎功能結(jié)果

2.2 硼替佐米對腎移植大鼠血清DSA的影響 見圖2。由圖2可見，術(shù)后1周硼替佐米組(G3)較之AMR組(G2)，血清IgM、IgG2b和IgG2c水平均顯著下降(P<0.05)。

圖2 硼替佐米對AMR腎移植大鼠血清DSA的影響

2.3 硼替佐米對腎移植大鼠腎臟病理損害的保護(hù)作用 見圖3。如圖3所示，AMR組(G2)大鼠移植腎臟呈現(xiàn)典型的急性AMR病理表現(xiàn)：腎小管周圍毛細(xì)血管和間質(zhì)內(nèi)單核巨噬細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞塊狀缺失，腎小球內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤等。硼替佐米組(G3)大鼠移植腎上述AMR表現(xiàn)明顯減輕。

2.4 硼替佐米對腎移植大鼠腎臟C4d表達(dá)的影響 見圖4。由圖4可見，AMR組(G2)移植腎組織中腎小管周圍毛細(xì)血管(PTC)上C4d均呈彌漫性表達(dá)，而硼替佐米組(G3)腎組織PTC上C4d均呈局灶性表達(dá)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 硼替佐米對移植腎巨噬細(xì)胞浸潤的影響 采用免疫熒光法標(biāo)記腎臟組織中巨噬細(xì)胞(紅色)，可見硼替佐米組(G3)大鼠移植腎組織中巨噬細(xì)胞表達(dá)呈中等強(qiáng)度表達(dá)，明顯少于AMR組(G2)，AMR組均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖5。

圖3 兩組腎臟典型病理改變(×200)

圖4 兩組腎移植大鼠腎臟C4d表達(dá)(×200)

圖5 兩組移植腎組織中CD68表達(dá)(×200)

3 討論

AMR已成為目前臨床上移植腎失功的主要原因之一[6]。由于缺乏針對AMR有效的藥物，其較細(xì)胞排斥更難于治療，且后果更為嚴(yán)重。目前AMR的治療主要包括血漿交換和免疫吸附等方法，旨在迅速降低循環(huán)中既有的DSA水平。盡管如此，治療效果仍不盡理想。因此，開發(fā)有效針對AMR的藥物成為進(jìn)一步提高腎移植患者術(shù)后長期存活的關(guān)鍵之一。

硼替佐米是一種強(qiáng)大的、可逆性的蛋白酶抑制劑，為FDA批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療[7]。硼替佐米可以抑制NF-κB誘導(dǎo)的存活信號，降低分化的漿細(xì)胞中蛋白酶的活性[8]。越來越多的資料顯示，硼替佐米用于臨床上治療頑固性AMR可以迅速降低血清DSA水平，改善移植腎功能，但是其具體機(jī)制目前并不清楚[3]。

本研究顯示，硼替佐米可以明顯抑制AMR大鼠血清中IgM、IgG2b和IgG2c等DSA亞型的水平，減少移植腎C4d的表達(dá)，顯著改善腎移植大鼠的腎臟功能，并且顯著減輕AMR大鼠移植腎的病理損害。表明硼替佐米具有抑制骨髓漿細(xì)胞產(chǎn)生DSA的能力，從而減輕DSA所誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活及腎臟損害。最近的研究顯示，單核巨噬細(xì)胞是腎移植AMR發(fā)生發(fā)展過程中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，是導(dǎo)致移植腎損害最重要的攻擊細(xì)胞[9-12]。本研究顯示，硼替佐米還可以明顯減少移植腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤。由此證明，硼替佐米對AMR移植腎的保護(hù)作用與其抑制移植腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤有密切關(guān)系，其具體途徑有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mengel M,Husain S,Hidalgo L,et al.Phenotypes of antibody-mediated rejection in organ transplants[J].Transpl Int,2012,25(6):611-622.

[2] Djamali A,Kaufman DB,Ellis TM,et al.Diagnosis and management of antibody-mediated rejection:current status and novel approaches[J].Am J Transplant,2014,14(2):255-271.

[3] Nigos JG,Arora S,Nath P,et al.Treatment of antibody-mediated rejection in kidney transplant recipients:a single-center experience with a bortezomib-based regimen[J].Exp Clin Transplant,2012,10(6):609-613.

[4] Sis B,Mengel M,Haas M,et al.Banff ′09 meeting report:antibody mediated graft deterioration and implementation of Banff working groups[J].Am J Transplant,2010,10(3):464-471.

[5] Mengel M,Sis B,Haas M,et al.Banff 2011 meeting report:new concepts in antibody-mediated rejection[J].Am J Transplant,2012,12(3):563-570.

[6] Haas M.Pathological features of antibody-mediated rejection in renal allografts:an expanding spectrum[J].Curr Opin NephrolHypertens,2012,21(3):264-271.

[7] 熊文杰,馮春銳,凌燕,等.硼替佐米聯(lián)合地塞米松治療多發(fā)性骨髓瘤26例臨床分析[J].中國醫(yī)師雜志,2012,14(6):835-837.

[8] 龐麗萍,陳甜甜,徐海嬋,等.硼替佐米聯(lián)合地塞米松方案治療多發(fā)性骨髓瘤分析[J].中國醫(yī)藥,2013,8(1):76-77.

[9] Sun HJ,Zhou T,Wang Y,et al.Macrophages and T lymphocytes are the predominant cells in intimal arteritis of resected renal allografts undergoing acute rejection[J].Transplant Immunol,2011,25(1):42-48.

[10]Sellares J,Reeve J,Loupy A,et al.Molecular diagnosis of antibody-mediated rejection in human kidney transplants[J].Am J Transplant,2013,13(4):971-983.

[11]Stegall MD,Chedid MF,Cornell LD.The role of complement in antibody-mediated rejection in kidney transplantation[J].Nat Rev Nephrol,2012,8(11):670-678.

[12]Salvadori M,Bertoni E.Impact of donor-specific antibodies on the outcomes of kidney graft:Pathophysiology,clinical,therapy[J].World J Transplant,2014,4(1):1-17.