李 蓉，鐘益剛，錢 康

0 引言

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是急性心肌梗死、心衰、卒中等心腦血管疾病的最主要發(fā)病原因。AS發(fā)生的原因是內(nèi)皮細胞受到損傷，細胞表面的粘附分子被激活后，導(dǎo)致血液中的單核細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞等免疫細胞吸附于內(nèi)皮，最后滲入血管內(nèi)膜[1]。還有一個重要原因就是血管中膜的平滑肌細胞(Smooth muscle cells，SMCs)大量增殖并侵入血管內(nèi)膜[2]。最終發(fā)生一系列的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，使得血管內(nèi)膜增厚，而血管管腔狹窄。而平滑肌遷移和增殖的一個重要因素是血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)。其不僅能夠?qū)ζ交〖毎?、成纖維細胞和中性粒細胞產(chǎn)生趨化作用，使得這些細胞遷移到內(nèi)膜，還能夠促進血管平滑肌細胞的分裂和增殖[3]。因此，PDGF在AS的形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。如果能夠?qū)够蛘咭种芇DGF誘導(dǎo)的平滑肌細胞增殖，就可以減緩內(nèi)膜增厚的進程，甚至可以預(yù)防和減緩AS的發(fā)生和發(fā)展，最終降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率。

人參皂苷Rb1(Rb1)是一種提取于人參、田七等名貴中藥的皂苷類化合物。Rb1對機體多個系統(tǒng)均有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。在心血管系統(tǒng)方面，具有保護血管內(nèi)皮細胞和預(yù)防AS的作用[4]。然而，Rb1能否對抗或者抑制PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌增殖并不完全明確。因此，本研究選擇Rb1作為干預(yù)因素，通過體內(nèi)外試驗來探討Rb1對大鼠主動脈血管平滑肌(Rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)增殖的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人參皂苷Rb1(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；PDGF-B(Sigma)；DMEM(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；MTT(Sigma)；DMSO(BD公司)；P53、P21、CDK2、CyclinE和PCNA單抗購于上海朗頓生物科技有限公司；小鼠α-SM-actin單抗、鏈霉親和素-生物素試劑盒(上海碧云天公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑(百奇生物科技有限公司)；SD大鼠25只(南京斯科瑞生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) RASMCs取自SD大鼠胸主動脈，按照陳雄林等[5]方法進行RASMCs原代培養(yǎng)。細胞傳到第3代后，用于后續(xù)實驗。使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2濕潤培養(yǎng)環(huán)境)。并加入100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素防止細菌污染。α-SM-actin檢測對RASMCs進行鑒定和純度分析。

1.3 MTT實驗 用于檢測PDGF-BB誘導(dǎo)RASMCs增殖的情況和Rb1抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的RASMCs增殖作用。PDGF-BB誘導(dǎo)增殖試驗分組(終濃度)：0、2、4、8、16、32 ng/mL共6組。每孔接種細胞濃度為5×104/mL的細胞懸液200 μL，培養(yǎng)24 h后換成無血清培養(yǎng)基200 μL。每組設(shè)置6個復(fù)孔，加入PDGF-BB后選擇24 h和48 h兩個檢測時間點。加入MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取上清液加入200 μL DMSO充分溶解，結(jié)晶后，于492 nm波長檢測OD值作生長曲線圖。Rb1抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的RASMCs增殖試驗分組：0(對照組)、20、40、80 μg/mL組。每孔接種細胞濃度為5×104/mL的細胞懸液200 μL，培養(yǎng)24 h后換成含Rb1無血清培養(yǎng)基200 μL。設(shè)置6個復(fù)孔，作用24 h。過程同上述MTT操作。結(jié)果計算公式：細胞活力=(Rb1作用組/對照組)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 用于檢測Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs凋亡的影響。將細胞分成4組：PDGF-BB組、PDGF-BB+20 μg/mL組、PDGF-BB+40 μg/mL組、PDGF-BB+80 μg/mL組。于6孔板中接種5×104/mL的細胞懸液(無血清培養(yǎng)基)2 L。PDGF-BB終濃度為16 ng/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后消化收集細胞于10 mL離心管，離心(1 000 r/min，5 min)洗滌2遍后1 mL PBS重懸細胞，加入FITC-Annexin V和PI各100 μL。室溫避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測。

1.5 流式細胞術(shù)測細胞周期 用于檢測Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs周期的影響。細胞分組：對照組(不加藥)、PDGF-BB組、80 μg/mL組、PDGF-BB+20 μg/mL組、PDGF-BB+40 μg/mL組、PDGF-BB+80 μg/mL組。具體操作：于6孔板中接種5×104/mL的細胞懸液(無血清培養(yǎng)基)2 L。PDGF-BB終濃度為16 ng/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后消化收集細胞，離心(1 000 r/min，5 min)洗滌2遍后用70%冰乙酸重懸細胞，-20 ℃固定過夜。PBS洗滌1次，去上清加入300 μL DNA染液(含碘化丙啶100 mg/L、RNA酶2×104U/L)37 ℃避光染色30 min，然后PBS洗滌2次，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6 Western blot 用于檢測Rb1作用PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs后，PNCA、CDK2、CyclinE、P53和P21的蛋白表達情況。分組同“1.5”項下分組方法，Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h。各種抗體濃度分別為：PNCA(1∶1 000)、CDK2(1∶1 000)、CyclinE(1∶1 000)、P53(1∶1 000)、P21(1∶1 200)。具體操作如下：將細胞消化收集于離心管中，離心洗滌2遍，加入裂解液置于4 ℃冰箱1 h后12 000 r/min離心10 min。吸取上清液測蛋白濃度。然后取等量蛋白質(zhì)溶液行SDS-PAGE電泳，獲取蛋白質(zhì)凝膠條后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維薄膜。牛奶封閉后加入相應(yīng)的單抗搖晃孵育2 h。PBS洗滌孵育單抗的膜條3遍，然后結(jié)合HRP-二抗。最后曝光、顯影、定影和掃描條帶分析光密度。

1.7 動物模型 頸動脈球囊損傷的SD大鼠模型建造參照張紓等[6]的造模方法。水合氯醛麻醉大鼠，固定后頸前正中切開，分離右頸總動脈和頸外動脈，經(jīng)頸外動脈插入2F球囊導(dǎo)管，注入生理鹽水使球囊充盈后緩慢來回推拉球囊導(dǎo)管3次?；爻樯睇}水后縫合傷口即可。大鼠分組：正常組、損傷非治療組、低劑量治療組[10 mg/(kg·d)]和高劑量治療組[30 mg/(kg·d)]。采取腹腔注射方式持續(xù)給藥14 d。

1.8 形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化分析 用于觀察Rb1治療大鼠頸動脈球囊損傷后的血管形態(tài)改變，分析血管內(nèi)膜PCNA、P53和P21的變化。處死大鼠后，切取損傷部位頸動脈，置于10%的甲醛中。制作成4 μm切片后，使用HE染色法染色觀察。隨機選取每只大鼠的3張切片，測量血管管腔面積和內(nèi)膜面積，并計算平均值，作為該只大鼠的血管形態(tài)學(xué)計量指標(使用Image-Pro Plus軟件)。免疫組化抗體工作濃度：PCNA(1∶200)、P53(1∶100)、P21(1∶100)。切片經(jīng)脫蠟至水后用上述抗體置于37 ℃孵育30 min進行結(jié)合。然后按照鏈霉親和素-生物素試劑盒說明進行操作，最后蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 RASMCs的鑒定 RASMCs經(jīng)免疫熒光檢測，α-SM-actin顯示紅色，形成的纖維與細胞縱軸平行(見圖1，黃色箭頭)。細胞核經(jīng)DAPI染色后顯示藍色(見圖1，白色箭頭)。隨機5個視野計數(shù)200個細胞，數(shù)3次。細胞無顯示紅色α-SM-actin為陰性細胞。結(jié)果顯示RASMCs純度達(95±1.4)%。

圖1 RASMCs免疫熒光分析(×200)

2.2 PDGF-BB誘導(dǎo)RASMCs增殖具有時間劑量依賴性 設(shè)置對照組、PDGF-BB組(2、4、8、16、32 ng/mL)共6組。作用RASMCs 24 h和48 h后，應(yīng)用MTT法檢測OD值。結(jié)果顯示，隨著PDGF-BB濃度的增加，細胞活力越來越高，與對照組(0 ng/mL)相比有顯著提高(P<0.05，見圖2)。而同一個濃度的不同時間點比較，發(fā)現(xiàn)48 h細胞活力高于24 h細胞活力(P<0.05，見圖2)。表明PDGF-BB誘導(dǎo)RASMCs增殖具有時間和劑量的依賴性。

圖2 PDGF-BB對RASMCs增殖的影響

2.3 Rb1能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的RASMCs增殖 選擇16 ng/mL的PDGF-BB作為RASMCs的增殖誘導(dǎo)濃度。Rb1分4個濃度組：0(對照組)、20、40、80 μg/mL。Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h后MTT法檢測并統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Rb1作用組細胞活力均比對照組低(P<0.05，見圖3)。而且Rb1高濃度組比低濃度組細胞活力低(P<0.05)。表明Rb1能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的RASMCs增殖，并且具有濃度劑量依賴性。另外，增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是反映細胞增殖的指標。通過檢測PCNA可以評價細胞增殖情況。本試驗檢測PCNA發(fā)現(xiàn)，隨著Rb1濃度增高，PCNA表達量逐漸減少，并且有劑量依賴性(P<0.05，見圖4)?？傊?，Rb1能夠明顯抑制RASMCs增殖。

圖3 Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)的RASMCs增殖的抑制作用

圖4 Rb1對RASMCs的PCNA表達的影響

2.4 Rb1誘導(dǎo)RASMCs的凋亡作用不明顯 選擇16 ng/mL的PDGF-BB作為RASMCs的增殖誘導(dǎo)濃度，Rb1分組同“2.3”。作用24 h后流式檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，4組的細胞凋亡率(早晚期)分別為：(3.2±0.3)%、(3.0±0.2)%、(4.3±0.4)%和(2.9±0.2)%。各個組間凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖5)。結(jié)合“2.3”項的結(jié)果，說明Rb1能夠抑制RASMCs增殖，但不誘導(dǎo)細胞凋亡。

圖5 Rb1對RASMCs凋亡的影響

2.5 Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs細胞周期的影響 將細胞分成6組：對照組(不加任何藥物)、Rb1(80 μg/mL)組、PDGF-BB組、PDGF-BB+Rb1(20 μg/mL)組、PDGF-BB+Rb1(40 μg/mL)組、PDGF-BB+Rb1(80 μg/mL)組，Rb1先作用24 h，再加入PDGF-BB刺激24 h。流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布。結(jié)果顯示，單藥Rb1對細胞周期影響不明顯(見圖6-b)；PDGF-BB能夠增加S期和G2/M期細胞比例(見圖6-c)；隨著Rb1的濃度增加，S期細胞逐漸減少，而G0/G1期細胞逐漸增加(見圖6-d、e、f)。綜上，PDGF-BB能夠誘導(dǎo)細胞進入增殖旺盛的S期和G2/M期，而Rb1能夠抑制PDGF-BB的這種作用，使細胞阻滯于G0/G1期。

2.6 Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs的CDK2和CyclinE的影響 細胞周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin-dependent kinases 2，CDK2)和CyclinE是細胞由G1期進入S期的關(guān)鍵蛋白。通過檢測這兩個蛋白的表達，可以了解Rb1在蛋白水平對RASMCs周期的影響。結(jié)果顯示，PDGF-BB誘導(dǎo)增殖后CDK2和CyclinE的表達上調(diào)。當Rb1作用后，CDK2和CyclinE的表達受到抑制，且具有一定的劑量依賴性(P<0.05，見圖7)。

圖7 Rb1對 RASMCs的CDK2和CyclinE表達的影響

2.7 Rb1對PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs的P53和P21的影響 P53和P21均為細胞增殖相關(guān)信號通路的重要蛋白分子，可以抑制細胞增殖，并且處于CDK2、CyclinE的上游。Rb1作用PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs后，CDK2、CyclinE明顯下調(diào)。因此，本試驗探討Rb1是否作用P53、P21而導(dǎo)致CDK2、CyclinE下調(diào)。結(jié)果顯示，與0 μg/mL組比較，P53和P21均有不同程度的上調(diào)(P<0.05，見圖8)。因此，可認為Rb1上調(diào)P53、P21后使得細胞增殖受到抑制。

2.8 Rb1對球囊損傷導(dǎo)致的大鼠頸動脈內(nèi)膜增厚的影響 將大鼠分成4組：正常組、非治療組、低劑量治療組[10 mg/(kg·d)]和高劑量治療組[30 mg/(kg·d)]。治療14 d后，測量頸動脈管腔面積和內(nèi)膜面積。與非治療組比較，治療組的管腔面積顯著增加，內(nèi)膜面積減小(P<0.01)。見表1。此外，蘇木精-曙紅染色后顯微鏡觀察直觀可見非治療組管腔明顯狹窄和內(nèi)膜增厚，治療后管腔變寬和內(nèi)膜變薄。見圖9。

圖8 Rb1對 RASMCs的P53和P21表達的影響

表1 Rb1治療后比較球囊損傷的頸動脈內(nèi)膜相關(guān)形態(tài)計量指標(mm2)

2.9 Rb1治療后PCNA、P53和P21在大鼠頸動脈內(nèi)膜的表達情況 免疫組化法檢測損傷非治療組、低劑量治療組和高劑量治療組大鼠頸動脈的PCNA、P53和P21的表達。結(jié)果顯示，低、高劑量治療組(圖10-B、C)的PCNA表達低于非治療組(圖10-A)；而P53和P21的表達高于非治療組。見圖10。此結(jié)果與體外實驗結(jié)果(Western blot法檢測)相類似。

圖9 Rb1治療后球囊損傷的頸動脈形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)異常增殖是AS發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。而在VSMCs異常增殖的過程中，PDGF-BB又起到非常重要的作用。PDGF-BB是一種最有效的細胞有絲分裂原和誘導(dǎo)劑，通過激活與其相關(guān)的分子體系導(dǎo)致VSMCs增殖[7]。如：PDGF-BB結(jié)合PDGFRβ后，通過激活ERK通路、MAPK通路和PI3K-Akt通路，最終促進VSMCs的增殖[8]。此外，其可以上調(diào)MMP-2的表達并導(dǎo)致VSMCs的遷移[9]。而本試驗在體外使用PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠主動脈平滑肌細胞增殖獲得了同樣的效果，并且具有時間劑量依賴性。此后，使用Rb1作用PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs，發(fā)現(xiàn)Rb1對其增殖具有抑制作用。Rb1對機體各個系統(tǒng)均有多種作用，而在心血管方面通過對抗氧化和同型半胱氨酸作用使得血管內(nèi)膜得到保護和修復(fù)[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)，Rb1能夠阻滯PDGF-BB誘導(dǎo)增殖的RASMCs于G0/G1，不增加細胞的凋亡。說明Rb1抑制細胞增殖是通過阻滯細胞進入分裂期，而不是誘導(dǎo)細胞凋亡。CDK2和CyclinE是細胞由G1期進入S期的關(guān)鍵分子之一，兩者結(jié)合后使其下游的pRb磷酸化，最后使得細胞順利進入S期[11]。通過檢測CDK2和CyclinE的表達可以了解藥物對細胞周期相關(guān)通路的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，Rb1作用后，RASMCs的CDK2和CyclinE表達受到抑制。進而再檢測兩者的上游分子P53和P21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P53和P21表達上調(diào)。P53是一種抑制腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子[12]，但同時在細胞周期阻滯中發(fā)揮重要作用，它可以激活下游的P21分子，而P21又能抑制CDK2/CyclinE復(fù)合體，最終阻滯細胞進入S期。

圖10 球囊損傷的大鼠頸動脈的PCNA、P53和P21的表達情況

在大鼠體內(nèi)實驗同樣證實了Rb1能夠抑制VSMCs增殖，使動脈管腔變寬和內(nèi)膜變薄。并且檢測到PCNA的下調(diào)、P53和P21的上調(diào)，與體外試驗結(jié)果一致。

總之，本研究證明了Rb1能夠有效抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖，而且是通過阻滯細胞于G0/G1期實現(xiàn)的。而這個過程與P53、P21的上調(diào)明顯相關(guān)。

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