馬 輝，范 青*，胡增春，胡慧敏，呂慧怡，程荔春，何玉芳，張 策，郝堂娜

0 引言

PC12細(xì)胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞系，主要分泌產(chǎn)物為兒茶酚胺類遞質(zhì)，包括多巴胺、去甲腎上腺素等。因其具有可傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，廣泛用于神經(jīng)生理、病理及藥理方面的研究，有助于闡明神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物療效，探索新的藥物與治療手段[1]。

丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TanⅡA)是丹參酮脂溶性成分的代表，藥理作用極其廣泛，包括抗氧化、抗炎、心肌保護(hù)、抗腫瘤等作用[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其抗腫瘤作用較為關(guān)注，發(fā)現(xiàn)TanⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡[3-4]?？鄥A(Matrine，Mat)作為一種傳統(tǒng)的中藥成分，在抗炎、抗心律失常方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，苦參堿具有較廣的抗瘤譜，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株及移植瘤有較高的抑制率[5-7]。川芎嗪(Ligustrazine，LZ)系從傳統(tǒng)中藥川芎中提取出來(lái)的有效生物堿成分，近年來(lái)，川芎嗪的抗腫瘤作用備受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，主要作用：逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)、免疫腫瘤、放療增敏、化療增效、抗腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。

大量文獻(xiàn)表明，丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪均有抗腫瘤活性，并且具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用。其中，川芎嗪能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖，且抑制作用表現(xiàn)為時(shí)效和量效關(guān)系；并能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡?？鄥A對(duì)人腦膠質(zhì)瘤BT325細(xì)胞具有明顯的增殖抑制和促進(jìn)凋亡的作用[9]。丹參酮ⅡA 能夠顯著降低人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87遷移作用[10]。本試驗(yàn)主要研究丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪對(duì)于PC12細(xì)胞的抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑 川芎嗪(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)、丹參酮ⅡA(西安保賽天然產(chǎn)物科技有限公司)、苦參堿(西安保賽天然產(chǎn)物科技有限公司)；胎牛血清(Hyclone公司)、PBS(北京中杉金橋公司)、DMEM(北京艾然生物科技有限公司)、MTT(北京索萊寶科技有限公司)、DMSO(Hyclone 公司)、NaHCO3(北京中杉金橋公司)、雙抗(青霉素及鏈霉素溶液，Hyclone 公司)、胰酶(美國(guó)Sigma)。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Sigma)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，倒置式生物顯微鏡(中國(guó)XD-101)，自動(dòng)渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，溶劑過(guò)濾器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，恒溫水浴箱(江蘇榮華儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 根據(jù)細(xì)胞的復(fù)蘇“慢凍快融”的原則：取出凍存的PC12細(xì)胞株，迅速放入37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)，將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化，立即加入到配制好的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液1次，連續(xù)傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 溶液的制備 丹參酮ⅡA溶液的制備：精密稱取丹參酮ⅡA 50 mg溶于6 mL DMSO中，得8.33 mg/mL的母液，用DMEM培養(yǎng)液稀釋得到濃度為20 μg/mL的溶液。置4 ℃冰箱中備用?？鄥A溶液的制備：精密稱取苦參堿12.8 mg溶于4 mL DMEM培養(yǎng)液中，得到濃度為3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中備用。川芎嗪溶液的制備：精密稱取川芎嗪12.8 mg溶于4 mL DMEM培養(yǎng)液中，超聲使其溶解，得到濃度為3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中備用。MTT溶液的制備：精密稱取MTT 40 mg，用8 mL PBS溶解，得到濃度為5 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) ①蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血細(xì)胞計(jì)數(shù)槽上。②制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸取細(xì)胞懸液、錐蟲藍(lán)染液(0.4%)各1滴，吹均勻。③將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：吸取少量吹勻的細(xì)胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，至蓋玻片下充滿懸液。④統(tǒng)計(jì)4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下，觀察計(jì)數(shù)。⑤計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/mL=(4個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×105。計(jì)算出細(xì)胞密度為9.28×106個(gè)/mL。

1.2.4 細(xì)胞鋪板 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶溶液(0.25%胰酶∶0.02%EDTA=1∶1，v/v)消化。將上述溶液用培養(yǎng)基稀釋，使細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為9.28×106個(gè)/mL，分別取100 μL接種于96孔板中，孵箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5 MTT法測(cè)定[11]37 ℃培養(yǎng)后，棄上清液，加入待測(cè)藥物，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入含0.2 mg/mL MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，并加入20 μL DMSO溶解MTT甲臜沉淀，置搖床上低速振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，混勻。在酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)量各孔的吸光度值A(chǔ)。抑制率=(A對(duì)照組-A給藥組)/A對(duì)照組×100%。

1.2.6 體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 用培養(yǎng)基將丹參酮ⅡA稀釋至濃度分別為：67.95、33.98、16.99、8.49、4.25、2.12、1.06、0.53、0.27 nmol/mL。用培養(yǎng)基將苦參堿稀釋至濃度分別為：12.89、6.44、3.22、1.61、0.81、0.40、0.20、0.10、0.05 μmol/mL。用培養(yǎng)基將川芎嗪稀釋至濃度分別為：23.50、11.75、5.87、2.94、1.47、0.73、0.37、0.18、0.09 μmol/mL。

按照MTT法，測(cè)量各孔的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算其抑制率，并用Origin軟件計(jì)算IC50值。每個(gè)濃度3個(gè)樣本，比較3種藥物的IC50值，從而比較其抗腫瘤活性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.1.1 丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 PC12細(xì)胞經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，細(xì)胞凋亡情況見圖1。如圖1所示，與對(duì)照組相比，低濃度丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。0.27 nmol/mL丹參酮ⅡA處理細(xì)胞后，胞體折光性好，突起明顯；當(dāng)用濃度為16.99 nmol/mL丹參酮ⅡA作用于PC12細(xì)胞時(shí)，顯示典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，核仁減少、固縮，折光性降低，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多，并沿核膜邊沿聚集，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的空泡；當(dāng)?shù)⑼駻濃度達(dá)67.95 nmol/mL時(shí)，細(xì)胞變圓離壁，突起減少，固縮，顆粒明顯增多，部分細(xì)胞漲大破裂。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.1.2 苦參堿對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 PC12細(xì)胞經(jīng)苦參堿處理后，細(xì)胞凋亡情況見圖2。由圖2可見，與對(duì)照組相比，0.05 μmol/mL苦參堿處理細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)好，胞體折光性好，突起明顯；苦參堿濃度達(dá)3.22 μmol/mL時(shí)，細(xì)胞固縮，突起減少，胞漿內(nèi)可見有顆粒，折光性減弱；當(dāng)苦參堿濃度達(dá)12.89 μmol/mL時(shí)，細(xì)胞輪廓變模糊，變圓離壁，突起減少，變短，胞漿內(nèi)顆粒明顯增多。

圖2 苦參堿對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.1.3 川芎嗪對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 PC12細(xì)胞經(jīng)川芎嗪處理后，細(xì)胞凋亡情況見圖3。如圖3所示，與對(duì)照組相比，川芎嗪濃度<0.09 μmol/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，輪廓清晰，胞體折光性好，細(xì)胞突起明顯；11.75 μmol/mL川芎嗪作用于PC12細(xì)胞24 h后，即對(duì)其細(xì)胞增殖有抑制作用，細(xì)胞突起減少，細(xì)胞折光性減弱，胞漿內(nèi)可見有顆粒；川芎嗪濃度達(dá)23.50 μmol/mL時(shí)，細(xì)胞輪廓變模糊，細(xì)胞變圓離壁，變短，部分細(xì)胞漲大破裂。

2.2 各給藥組IC50值比較 各給藥組IC50值結(jié)果見表1。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖4，由圖4可知，這3種藥物不同濃度時(shí)，都能有效抑制PC12細(xì)胞的增殖，且細(xì)胞生長(zhǎng)率隨著藥物濃度的增加而增大。當(dāng)?shù)⑼駻的藥物濃度≤0.27 nmol/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用不明顯；隨著藥物濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)藥物濃度達(dá)23.21 nmol/mL時(shí)，其抑制率達(dá)50%。當(dāng)苦參堿的藥物濃度≤0.05 μmol/mL時(shí)，藥物對(duì)于細(xì)胞的抑制作用不明顯；當(dāng)藥物濃度達(dá)11.36 μmol/mL時(shí)，即能夠?qū)霐?shù)細(xì)胞殺死。當(dāng)川芎嗪的藥物濃度≤ 0.09 μmol/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用；當(dāng)藥物濃度達(dá)20.32 μmol/mL時(shí)，其抑制率達(dá)50%。通過(guò)這3種抗腫瘤藥物的實(shí)驗(yàn)研究可知，丹參酮ⅡA與川芎嗪及苦參堿對(duì)比，具有顯著的抗腫瘤活性。

表1 4種藥物對(duì)PC12細(xì)胞株的抑制作用比較

圖3 川芎嗪對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討論

目前，惡性腫瘤的治療方法仍然是以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療。臨床常用的化療藥物主要是通過(guò)細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞，但由于大多數(shù)化療藥物毒性大，許多患者難以承受[12]。另一方面，某些腫瘤細(xì)胞因?qū)熕幬锘蚍派渚€不敏感而導(dǎo)致治療效果不理想。因此，臨床急需開發(fā)毒性小、治療效果好的抗腫瘤藥物，可以降低患者死亡率及減小化療藥物的毒副作用，并提高其生活質(zhì)量。近年來(lái)，許多中藥單體具有非常好的抗腫瘤活性，而且毒副作用較小，其抗腫瘤作用機(jī)制除直接殺死腫瘤細(xì)胞之外，還與逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥有關(guān)。

本試驗(yàn)應(yīng)用MTT比色法觀察丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，通過(guò)丹參酮ⅡA與苦參堿及川芎嗪進(jìn)行比較，三者的抗腫瘤活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3種抗腫瘤藥物的IC50值分別為23.21 nmol/mL、11.36 μmol/mL、20.32 μmol/mL，表明3種藥物對(duì)PC12細(xì)胞都具有抗腫瘤作用，但由于川芎嗪和苦參堿只有在濃度很高時(shí)才能發(fā)揮明顯的抑制作用，所以其毒性較大，安全范圍小。丹參酮ⅡA主要用于冠心病、痤瘡、痛經(jīng)、失眠及抗菌消炎等非腫瘤疾病的治療，近年研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA還具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，可能成為一種很有潛力的抗癌新藥。丹參酮ⅡA在濃度很低時(shí)，即對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其濃度與抑制率呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)。研究表明，丹參酮ⅡA的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[13-14]。結(jié)合進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)，包括血腦屏障試驗(yàn)、間質(zhì)內(nèi)療法等，可為丹參酮ⅡA最終用于交感神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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