田 楓，任 波，張?jiān)气P，馬利偉，鄭振輝

(1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，北京 100191；2.北京大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100191)

進(jìn)入二十一世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始應(yīng)用基因修飾小鼠進(jìn)行各種科學(xué)研究，如研究疾病的發(fā)生機(jī)制、研究基因的表達(dá)與調(diào)控、研究藥物的作用機(jī)制等。然而隨著基因修飾小鼠的廣泛使用，在飼養(yǎng)管理中必然會(huì)遇到一些新情況，這些新情況、新問(wèn)題對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)者和管理者而言也是一個(gè)嶄新的課題。本文以北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中飼養(yǎng)的基因修飾小鼠為對(duì)象，著重探討在管理和使用中出現(xiàn)的問(wèn)題，并加以分析，為建立基因修飾小鼠的管理規(guī)范奠定基礎(chǔ)。

1 飼養(yǎng)在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中基因修飾小鼠的概況

基因修飾小鼠包括轉(zhuǎn)基因小鼠、基因敲除小鼠和基因敲入小鼠。根據(jù)我們記錄的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)統(tǒng)計(jì)，截止到目前，在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中飼養(yǎng)的基因修飾小鼠達(dá)100多個(gè)大類(lèi)，涉及的實(shí)驗(yàn)單位為80多個(gè)。這些小鼠大都是2004年以后，從不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中陸續(xù)引入的。而且近一、二年來(lái)，引入的基因修飾小鼠呈逐漸增加的趨勢(shì)。

2 基因修飾小鼠在飼養(yǎng)管理和使用中存在的問(wèn)題

2.1 來(lái)源的復(fù)雜性與質(zhì)量控制問(wèn)題

對(duì)于從國(guó)外引進(jìn)的動(dòng)物，我們制定了一整套完整的操作規(guī)程[1]，實(shí)驗(yàn)人員須嚴(yán)格按照進(jìn)口程序完成。對(duì)于從國(guó)內(nèi)其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中引進(jìn)基因修飾小鼠，我們亦制定了相應(yīng)的執(zhí)行辦法。實(shí)驗(yàn)人員須先提出申請(qǐng)，進(jìn)入清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施之前須提供近三個(gè)月的將引進(jìn)的品系小鼠或與該小鼠處于相同飼養(yǎng)環(huán)境的小鼠的動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告。動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于清潔級(jí)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)，并且要求檢測(cè)結(jié)果需符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]。

清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施承擔(dān)著醫(yī)學(xué)部及各大附屬醫(yī)院的大、小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，涉及的研究范圍、研究領(lǐng)域非常廣泛?？蒲腥藛T使用的基因修飾小鼠來(lái)源也是多途徑、多渠道的，總結(jié)起來(lái)主要有以下五個(gè)來(lái)源。

2.1.1 國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中引進(jìn)

從國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中引進(jìn)的小鼠主要來(lái)自于杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory) 和查士利華實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratory)。The Jackson Laboratory作為全球小鼠模型資源中心，保有3，000多個(gè)品系，并向全世界科研機(jī)構(gòu)提供。Charles River Laboratory是世界上最大的實(shí)驗(yàn)大、小鼠商品化生產(chǎn)銷(xiāo)售公司。從這兩大公司引進(jìn)的小鼠質(zhì)量比較有保障。

2.1.2 國(guó)外某大學(xué)或研究機(jī)構(gòu)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中引進(jìn)

有的研究者與國(guó)外的某些大學(xué)或研究機(jī)構(gòu)科研人員合作，常常通過(guò)科研贈(zèng)送的形式，將國(guó)外的基因修飾小鼠引進(jìn)國(guó)內(nèi)。

2.1.3 國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)中購(gòu)進(jìn)

國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)位于南京大學(xué)，也是目前國(guó)內(nèi)基因修飾小鼠的主要來(lái)源。

2.1.4 國(guó)內(nèi)某研究機(jī)構(gòu)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中引進(jìn)

國(guó)內(nèi)某些研究機(jī)構(gòu)也保有一些基因修飾小鼠。實(shí)驗(yàn)人員將在其他科研院所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)的小鼠引進(jìn)到我們的設(shè)施中進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。

2.1.5 國(guó)內(nèi)制作基因修飾小鼠的公司或科研機(jī)構(gòu)引進(jìn)

對(duì)于國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有的基因修飾小鼠，研究人員委托國(guó)內(nèi)的專(zhuān)門(mén)制作基因修飾小鼠的公司或科研機(jī)構(gòu)制作目標(biāo)品系的小鼠，以供實(shí)驗(yàn)所用。在相應(yīng)的公司或科研機(jī)構(gòu)制作成功后，引進(jìn)到我們的設(shè)施中進(jìn)行飼養(yǎng)繁育及實(shí)驗(yàn)。

盡管我們制定了相應(yīng)的規(guī)章制度，也是嚴(yán)格的按照制度執(zhí)行，但是由于動(dòng)物來(lái)自于多個(gè)設(shè)施，各個(gè)設(shè)施管理水平不均，而且運(yùn)輸過(guò)程中存在不可控因素和不確定性，都會(huì)影響到引入到我們?cè)O(shè)施中動(dòng)物的質(zhì)量。

2.2 長(zhǎng)期保種繁育中的問(wèn)題

無(wú)論從國(guó)外引進(jìn)還是從國(guó)內(nèi)引進(jìn)的基因修飾小鼠，引進(jìn)的數(shù)量都相對(duì)有限，一般為2-3對(duì)。首先需進(jìn)行交配、繁殖擴(kuò)大種群，待種群數(shù)量足夠時(shí)，研究人員方開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，種群數(shù)量長(zhǎng)期保持在一定的數(shù)量才能保證實(shí)驗(yàn)所需。通常而言，引進(jìn)的小鼠涉及實(shí)驗(yàn)都是一個(gè)長(zhǎng)期的、連續(xù)的研究工作，不會(huì)在幾個(gè)月以內(nèi)就結(jié)束，短則一、二年、長(zhǎng)則幾年以上，由于研究工作的連續(xù)性導(dǎo)致不太可能采用胚胎冷凍的方法保種。同時(shí)在繁育過(guò)程中，基因修飾小鼠不同于正常的小鼠，往往需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確?；蛐揎椀恼_性。

問(wèn)題在于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施不同于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)設(shè)施，人員流動(dòng)性大，設(shè)施中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)各種各樣，會(huì)給長(zhǎng)期繁育動(dòng)物造成不良影響。建議在可能的情況下，當(dāng)種群擴(kuò)大到一定數(shù)量時(shí)，通過(guò)剖腹凈化，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)設(shè)施中保種、繁育，在生產(chǎn)設(shè)施中保種、繁育的動(dòng)物可確保質(zhì)量。當(dāng)實(shí)驗(yàn)人員需要時(shí)再?gòu)纳a(chǎn)設(shè)施中取出到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是這樣的做法可能加重了生產(chǎn)設(shè)施的負(fù)擔(dān)及實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)不便。

2.3 飼養(yǎng)繁育中飼養(yǎng)人員水平問(wèn)題

基因修飾小鼠的廣泛使用，給飼養(yǎng)管理人員提出了新要求。由于基因修飾小鼠的特性，在繁育過(guò)程可能繁殖力比較低，需要飼養(yǎng)管理人員配合實(shí)驗(yàn)人員選好種、育好種；也可能動(dòng)物出現(xiàn)的某些病理變化正是基因修飾后小鼠特有的變化，需要飼養(yǎng)管理人員認(rèn)真觀察動(dòng)物狀態(tài)，認(rèn)真記錄，及時(shí)反饋給實(shí)驗(yàn)者。基因修飾小鼠的品系名稱一般比較復(fù)雜，需要飼養(yǎng)管理人員具備一定的英文基礎(chǔ)，在記錄繁育卡片時(shí)確保品系名稱的正確性，因?yàn)橐粋€(gè)字母或符號(hào)的錯(cuò)誤可能就會(huì)混淆了小鼠的品系，給科研工作帶來(lái)?yè)p失。從現(xiàn)在情況來(lái)看，在未來(lái)的研究中小鼠模型將大多是多基因修飾的小鼠模型，可能是雙基因敲除小鼠、三基因敲除小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠與基因敲除小鼠交配的模型等。因此與傳統(tǒng)繁育小鼠相比，繁育基因修飾小鼠的工作對(duì)飼養(yǎng)人員提出了更高的要求，要求具備相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)背景知識(shí)和專(zhuān)業(yè)的技能，飼養(yǎng)管理人員需緊跟科研發(fā)展的步伐。

但事實(shí)卻是由于飼養(yǎng)管理工作的性質(zhì)，行業(yè)內(nèi)飼養(yǎng)人員的整體素質(zhì)偏低是不可回避的事實(shí)。今后將吸納更多的具有相關(guān)背景知識(shí)的人員從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)服務(wù)工作，從軟件上提高基因修飾動(dòng)物的管理水平。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有從業(yè)人員的專(zhuān)業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，使之不斷適應(yīng)新形勢(shì)的需要。

2.4 使用基因修飾小鼠過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員的問(wèn)題

對(duì)于進(jìn)入清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施的實(shí)驗(yàn)人員我們要求必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員上崗培訓(xùn)并通過(guò)考試，獲得北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)協(xié)會(huì)頒發(fā)的《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員崗位證書(shū)》。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前還要簽署清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)知情同意書(shū)，內(nèi)容包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)執(zhí)行程序、實(shí)驗(yàn)人員須知、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定等。

實(shí)驗(yàn)人員大都是醫(yī)學(xué)部及各大附屬醫(yī)院的研究生，雖然使用基因修飾小鼠的實(shí)驗(yàn)課題是連續(xù)性的，但是人員流動(dòng)性比較大，盡管有的研究生具備崗位證書(shū)，但剛開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的知識(shí)掌握比較有限，技術(shù)操作也不甚熟練，這也會(huì)直接影響到基因修飾小鼠的管理，但當(dāng)他們熟練掌握了相關(guān)的技術(shù)之后，他們的實(shí)驗(yàn)工作可能已經(jīng)結(jié)束，新的研究生繼續(xù)他們的課題研究。同樣新的研究生也面臨這樣的一個(gè)過(guò)程，從陌生到熟悉到離開(kāi)。在高校這個(gè)特殊的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域，如何使研究人員盡快進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角色需要多方面加以努力。

3 小結(jié)

綜上所述，基因修飾小鼠在飼養(yǎng)管理及使用中出現(xiàn)的問(wèn)題，是生命科學(xué)研究中不可避免的，希望引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理者的足夠重視，能夠建立起完善的關(guān)于基因修飾動(dòng)物的管理規(guī)范，為科研工作奠定良好的基礎(chǔ)，推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田楓，康愛(ài)君，鄭振輝，等. 疾病小鼠模型的引進(jìn)及其繁育保種實(shí)踐[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(9)：84-86.

[2] 李根平，邵軍石，李學(xué)勇. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用手冊(cè)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010.