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新型小鼠跨區(qū)供血耳瓣模型的構(gòu)建

2014-08-14 06:56:46莊躍宏鄭和平吳劍威謝志平
中國骨質(zhì)疏松雜志 2014年7期
關(guān)鍵詞:跨區(qū)供區(qū)管徑

梁 成,莊躍宏,鄭和平,吳劍威,馬 雷,謝志平

(1.福建醫(yī)科大學(xué)??偱R床醫(yī)學(xué)院(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)比較醫(yī)學(xué)科,福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系,福州 350108)

腫瘤切除、燒傷,特別是交通傷等引起的較大面積軟組織缺損,面積往往超過單個軸形皮瓣的覆蓋能力,臨床醫(yī)生根據(jù)缺損修復(fù)的需要,將皮瓣擴(kuò)大切取,超出解剖供區(qū)的限制,甚至到達(dá)遠(yuǎn)鄰的潛力供區(qū),這就是所謂的跨區(qū)皮瓣[1]??鐓^(qū)皮瓣切取后,皮瓣需跨過血管體之間的吻合血管,也就是Taylor[2]認(rèn)為的choke血管向皮瓣遠(yuǎn)端供血。生理狀態(tài)下吻合血管管徑極其細(xì)小,是跨區(qū)皮瓣切取后血流以足夠的速率與量通往遠(yuǎn)端的最大障礙,因此皮瓣能完全存活的關(guān)鍵在于不同區(qū)域間的吻合血管是否都能擴(kuò)張成為真性吻合。因此,對跨區(qū)皮瓣血管體間的choke血管在皮瓣切取后的生物學(xué)變化進(jìn)行深入研究,對提高跨區(qū)皮瓣的存活率有重要的意義。目前,幾種研究choke血管的動物模型,均存在較明顯的缺陷[3-5]。本研究在觀察小鼠耳的血管分布情況后,在小鼠耳上切取跨三區(qū)皮瓣,不僅成功觀察到吻合區(qū)血管的形態(tài)變化過程,也得到一穩(wěn)定的皮瓣壞死模型,為以后進(jìn)一步研究血管擴(kuò)張機(jī)制及遴選促皮瓣存活藥物的理想動物模型奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 可編程數(shù)控二維精密圖像采集系統(tǒng)設(shè)計

可編程數(shù)控二維精密圖像采集系統(tǒng)(圖1)。包括:十字滑臺、數(shù)控兩軸運(yùn)動控制器、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器、步進(jìn)電機(jī)、電源、動物承載臺、體視顯微鏡,數(shù)碼相機(jī)。①十字滑臺:精度0.01 mm;②控制器:可編輯程序;③動物承載臺(圖2):載物臺的中間鏤一直徑為2 cm的圓孔,主要用來增加透光性。圓孔上粘貼一塊(3×2×0.4)cm的小有機(jī)玻璃板,主要用于放置鼠耳。在小有機(jī)玻璃板的兩側(cè)粘兩小有機(jī)玻璃條,比中間小有機(jī)玻璃板高1 mm便可,用于放置載玻片壓平鼠耳,但又不至于阻斷鼠耳血供;④體視顯微鏡(moticam 1300);⑤數(shù)碼相機(jī)(OLYMPUS SZ-16)。

注:1. 置耳臺;2.玻片臺;3,玻片。

由于滑臺的高度與軸長限制,與顯微鏡物距無法匹配,決定了動物承載臺和滑臺不能直接組合置于物鏡下。因此,必須要做一個足夠面積的有機(jī)玻璃托板,將動物承載臺連接并間接固定在滑臺上,通過滑臺的往復(fù)運(yùn)動,帶動動物承載臺運(yùn)動,從而巧妙地實現(xiàn)鼠耳按“弓”型路線準(zhǔn)確步進(jìn)。

1.2 實驗動物

30只清潔級ICR小鼠,雄性,體重25~30 g,鼠耳完整無皮膚病變或外傷,由福建醫(yī)科大學(xué)動物中心【SCXK(閩)2012-0001】提供;飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科屏障環(huán)境【SYXK(閩)2013-0004】,環(huán)境溫度22±1℃,相對濕度40%~65%。

1.3 模型建立

用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)將小鼠麻醉成功后,商業(yè)人用脫毛膏鼠耳脫毛并用流水沖凈,體視顯微鏡下(×25)觀察鼠耳的血管分布情況。根據(jù)觀察結(jié)果,用眼科剪從尾側(cè)向頭側(cè)剪斷小鼠耳基底部尾側(cè)2/3,保留頭側(cè)1/3,形成以耳前動靜脈為蒂內(nèi)含三個血管體、二個choke區(qū)的跨區(qū)供血耳瓣。

1.4 圖像采集

小鼠麻醉成功后,側(cè)臥置于圖像采集系統(tǒng)的動物承載臺上,鼠耳蓋上載玻片,盡量展平鼠耳。調(diào)節(jié)體視顯微鏡物鏡并固定為25倍;設(shè)置步進(jìn)參數(shù),使動物承載臺在X、Y軸上步進(jìn)距離0.25 cm/次,間隔時間為5 s,行進(jìn)路線為“弓”型。動物承載臺每移動一次采集一次圖像,每只小鼠整耳大概需采集10張圖像。圖像采集時間點(diǎn)為耳瓣切取后0,1,2,3,4,5,6,7,10,14,21,30 d。

1.5 數(shù)據(jù)測量及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 鼠耳的血管分布

鼠耳面積約為1.5×1.3 cm,厚度約為0.3 mm,透光度好。在體視顯微鏡下清晰可見3條血管束:尾側(cè)血管束、中間血管束及頭側(cè)血管束。每個血管束均有一條動脈與相伴行的靜脈,動脈直徑為0.2~0.5 mm,靜脈直徑為0.9~2.1 mm。頭側(cè)血管束進(jìn)入鼠耳基底部后,沿著鼠耳前側(cè)緣走行。尾側(cè)血管束在整個走形過程中分支較少,末端與中間血管體的內(nèi)側(cè)分支吻合。中間血管體在進(jìn)入基底部后往往分為三大支,中間支垂直向上走行,內(nèi)側(cè)支往內(nèi)側(cè)走行,與頭側(cè)血管體吻合;尾側(cè)血管體在進(jìn)入基底部前往往分為兩支,兩支一并進(jìn)入耳體,與中間血管外側(cè)分支往往有細(xì)小吻合。頭側(cè)血管體與尾側(cè)血管體分別約供應(yīng)1/4的耳體,中間血管體約供應(yīng)1/2的耳體(圖3A)。

2.2 耳瓣內(nèi)血管管徑變化及壞死面積

術(shù)后即刻,耳瓣透光性最佳,動靜脈均清晰可見。術(shù)后24 h,便可以觀察到第三血管體所供應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)部分壞死的征象:高倍鏡(×100)下可見血管內(nèi)無血液流動,組織脫水,血管周圍出現(xiàn)眾多紅斑,為溢出的紅細(xì)胞。術(shù)后4 d,耳瓣水腫較為厲害,致使其透光性有所降低,在顯微鏡下耳瓣整體較為暗淡,靜脈依然較為清晰,但動脈觀察則有點(diǎn)困難。術(shù)后5 d,耳瓣壞死面積趨于穩(wěn)定,壞死率為(15±7)%(彩插5圖3B )。耳瓣術(shù)后,頭側(cè)血管體與中間血管體之間的choke動、靜脈的管徑出現(xiàn)快速擴(kuò)增,兩者都在第10天左右達(dá)到最大,choke靜脈管徑最高峰可到達(dá)原來的(3.9±0.5)倍,choke動脈管徑最高峰可達(dá)到原來的(3.5±0.7)倍。10 d后,choke靜脈管徑開始減小,21 d后逐漸平穩(wěn),而choke動脈管徑于術(shù)后10 d左右開始平穩(wěn),之后無明顯減小(圖4)。在中間血管體與尾側(cè)血管體之間擴(kuò)張的choke血管數(shù)量及幅度多小于第一choke區(qū),在少數(shù)出現(xiàn)較明顯擴(kuò)張的耳瓣中,第三血管體所支配的區(qū)域壞死率出現(xiàn)明顯降低(彩插5圖5)。耳瓣切取后30 d內(nèi),很多小鼠鼠耳上可以觀察到第二血管體內(nèi)的靜脈除了與頭側(cè)血管體直接相連的內(nèi)側(cè)分支管徑增加后處于一個較平穩(wěn)的狀態(tài),其它兩個分支內(nèi)的靜脈在耳瓣切取后4 d左右,由于靜脈回流障礙出現(xiàn)的靜脈被動擴(kuò)張,而后期耳瓣皮瓣血供重構(gòu)穩(wěn)定后,擴(kuò)張的靜脈明顯萎縮、退化,管徑比耳瓣切取前減小。皮瓣會出現(xiàn)一個明顯的靜脈回流軸向,尾側(cè)血管體內(nèi)的未壞死部分的靜脈在耳瓣基底部通過細(xì)小的靜脈連到第二血管體的基部,后通過第二血管體的內(nèi)側(cè)分支直接到內(nèi)側(cè)血管體。

圖4 choke血管管徑變化趨勢

3 討論

3.1 跨區(qū)供血皮瓣的概念及本實驗結(jié)果對其存活機(jī)制的提示

人體皮膚的每一支動脈均有一個明確的供血范圍,即解剖學(xué)供區(qū)。每一個解剖學(xué)供區(qū)與其周圍相鄰動脈之間均有豐富的吻合,Taylor等[2]將這種吻合稱為choke血管。一側(cè)血管被切斷或阻斷時,其管道內(nèi)血壓下降,此時,解剖學(xué)供區(qū)血管內(nèi)的血流就會跨越原來的吻合部位(choke vessels)向遠(yuǎn)端供血。這種緊鄰解剖學(xué)供區(qū)的擴(kuò)張部分被稱之為血流動力學(xué)供區(qū)(dynamic territory)。在跨越動力學(xué)供區(qū)的基礎(chǔ)上,若再繼續(xù)向遠(yuǎn)鄰的供區(qū)延伸,則稱其為潛力供區(qū)(potential territory)。這表明:可將皮瓣從解剖學(xué)供區(qū)向緊鄰的動力學(xué)供區(qū)擴(kuò)張切取,若再繼續(xù)向遠(yuǎn)鄰的潛力供區(qū)延伸,則可得到更大的皮瓣[1],這就是所謂的跨區(qū)供血皮瓣。臨床經(jīng)驗及動物實驗提示跨區(qū)皮瓣切取后,動力供區(qū)往往能夠順利存活,而皮瓣壞死最容易出現(xiàn)在動力供區(qū)與潛力供區(qū)之間choke區(qū)及其遠(yuǎn)端潛力供區(qū)部分,其原因有待深入研究[7]。

耳瓣切取后,耳瓣內(nèi)靜脈在早期均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張,而后期很多擴(kuò)張靜脈又出現(xiàn)回縮,管徑較小,甚至消失,提示耳瓣內(nèi)靜脈早期的擴(kuò)張可能屬于被動擴(kuò)張,可能是靜脈回流瘀滯的一個表現(xiàn)。皮瓣切取后7 d左右,慢慢就能看到耳瓣內(nèi)一個明顯的靜脈回流軸向:尾側(cè)血管體內(nèi)的未壞死部分的靜脈在耳瓣基底部通過細(xì)小的靜脈連到第二血管體的基部,而后通過第二血管體內(nèi)側(cè)分支直接到頭側(cè)血管體,耳瓣內(nèi)靜脈似乎都是選擇以最短距離回到蒂部。而皮瓣動脈沒有明顯的管徑增加又回縮的現(xiàn)象,提示動脈擴(kuò)張早期可能是因為失神經(jīng)或者代謝產(chǎn)物積累、缺氧等原因造成血管的擴(kuò)張,只是彈性的擴(kuò)張期,之后出現(xiàn)動脈壁細(xì)胞的增值,屬于主動增值。

3.2 耳瓣模型的優(yōu)缺點(diǎn)

耳瓣模型與目前文獻(xiàn)上報道的用于跨區(qū)供血皮瓣研究的動物模型相比有以下優(yōu)點(diǎn):⑴耳瓣切取后,耳瓣內(nèi)整個血管的形態(tài)學(xué)變化可在活體上長時間觀察,明顯優(yōu)于文獻(xiàn)上報道的在大鼠或兔子背部切取皮瓣,再按照時間點(diǎn)分批處死動物進(jìn)行血管造影的方法。目前文獻(xiàn)上報道的動物皮窗模型是另外一種能夠?qū)崿F(xiàn)對皮瓣切取后皮瓣內(nèi)血管形態(tài)學(xué)活體長時間觀察的方法[3-4]。小鼠耳瓣模型與皮窗模型相比有較明顯的優(yōu)點(diǎn): ①不用安裝皮窗,避免了很大的一個干擾因素;②避免皮下組織直接暴露于皮下,大大減小動物的感染率和致死率,提高模型的成功率;③操作方便,不用安裝皮窗,不用縫皮,與每只大鼠皮窗模型至少需30 min制作相比,耳瓣模型從耳瓣制作到照片合成完畢只需5~8 min;⑵耳瓣內(nèi)壞死與成活的組織界限清晰可見,耳瓣壞死率容易精確計算。我們認(rèn)為該模型是最好的用于篩選具有血管活性,能促進(jìn)皮瓣存活的藥物;⑶小鼠耳成對,可互相作為對照組。小鼠耳瓣模型作為跨區(qū)皮瓣模型最大的缺點(diǎn)在于鼠耳屬于復(fù)合組織,除了皮膚還有軟骨,與單純的皮瓣相比,其生理可能存在不同。

3.3 鼠耳模型建立要點(diǎn)

耳瓣模型的制作過程中需注意以下兩點(diǎn):①當(dāng)耳瓣切取后,由于疼痛,小鼠具有相互啃咬的天性,不恰當(dāng)?shù)娜︷B(yǎng)會導(dǎo)致小鼠相互啃咬耳瓣,并增加小鼠耳瓣感染可能性,使試驗功虧一簣,本模型中必須保證所有小鼠單獨(dú)飼養(yǎng);②不恰當(dāng)?shù)姆胖蒙w玻片會壓癟甚至截斷鼠耳中正常的血流,影響試驗的統(tǒng)計,所以兩側(cè)的架高條的高度必須適中,給蓋玻片和鼠耳留有一定空間,既能保證鼠耳鋪平又能保證血流通暢。

綜上所述,本課題建立的鼠耳模型能清晰的對跨區(qū)皮瓣微循環(huán)的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行長時間的活體觀察,并具有穩(wěn)定壞死率,不失為研究血管擴(kuò)張機(jī)制及遴選促皮瓣存活藥物的理想動物模型。

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