劉樹民，崔曉旭，陳平平，王可心，汪 娜，柳長鳳

(黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江中醫(yī)藥大學北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

甲狀腺功能亢進癥(簡稱甲亢)系指多種病因?qū)е录谞钕俟δ茉鰪?，甲狀腺激素分泌過所致的臨床綜合征[1]。臨床上主要有抗甲狀腺藥、手術(shù)、131I輻射治療等幾種方式，但均有一定的禁忌癥和副作用，近年來采用中醫(yī)藥治療甲亢在臨床上取得了較好的療效，而復(fù)制出穩(wěn)定可持續(xù)的甲亢動物模型對于開發(fā)有效的治療甲亢的藥物是必不可少的，藥物治療大致分為預(yù)防給藥和治療給藥兩種方式，對于持續(xù)性好的模型可以采用治療給藥的方式，但如果持續(xù)性不好即恢復(fù)較快的模型，采用治療給藥的方式起不到評價藥效的作用，而應(yīng)采用預(yù)防給藥的方式，基于此，本文從較經(jīng)典的造模方法中選取了兩種造模方法：大鼠口服優(yōu)甲樂[2-3]和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌尾靜脈注射[4-5]免疫造模，復(fù)制這兩種甲亢動物模型，除常規(guī)的生化和病理指標檢測外，引入代謝組學技術(shù)，利用液質(zhì)檢測模型尿液的代謝指紋圖譜，從代謝的整體變化評價模型，通過此研究比較了兩種不同方式復(fù)制模型的成型性及持續(xù)性，以期為研究治療甲亢的藥物提供良好的評價載體。

1 材料和方法

1.1 儀器

美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀；美國Waters LCT Premier XE飛行時間質(zhì)譜儀；DFM-96型16管放謝免疫γ計數(shù)器，合肥眾成機電技術(shù)開發(fā)有限責任公司；CLASS TYPEB2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DC-160HR高速冷凍離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 試劑及制備方法

優(yōu)甲樂(左甲狀腺素鈉片)：德國默克公司，生產(chǎn)批號147408，進口藥品注冊證H20100528，規(guī)格50 μg/片×100片；取優(yōu)甲樂用蒸餾水配成濃度為50 μg/mL的混懸液；

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌：由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，菌株標準編號：FSCC234002，批號：A0121B，有效期到：2014/08/25；取小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌種復(fù)蘇傳代后，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增菌，離心收集細菌沉淀后用0.03%甲醛溶液固定，最后用生理鹽水制備成濃度為5×108個/mL的細菌懸液；

放免試劑盒：濰坊三維生物工程集團有限公司，T3批號120815，T4批號130706，F(xiàn)T3批號130518，F(xiàn)T4批號130621；TSH批號130302，按說明書操作。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雌性，體重200±20 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京) 2007-0001】；動物實驗在黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心完成【SYXK(黑)2008-001】，大鼠于屏障環(huán)境動物室內(nèi)標準條件下飼養(yǎng)，大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開始試驗。

1.4 動物模型的制備

1.4.1 優(yōu)甲樂模型制備

取SD雌性大鼠20只，分為空白組和模型組，模型組灌胃給予優(yōu)甲樂50 μg/100g鼠重，給藥21 d，空白組給予同等劑量的蒸餾水，于造模后第1、7、14天分別于眼底取血，全血樣品于4℃，3000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冷凍后待測，并于最后一次取血后取大鼠的甲狀腺組織于4%甲醛溶液中固定；同時于代謝籠中接取第1、7、14天的12 h尿液，尿液樣品于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清液進UPLC-MS檢測。

1.4.2 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型制備

取SD雌性大鼠20只，分為空白組和模型組，模型組尾靜脈注射5×108個/mL的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌細菌懸液免疫造模，注射時間為第0、5、10、15、20天共5次，給菌量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL依次增多，空白組給予等量的生理鹽水造模，于末次注射后第5、15、25天大鼠眼底取血，全血樣品于4℃，3000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冷凍后待測，并于最后一次取血后取大鼠的甲狀腺組織于4%甲醛溶液中固定；同時于代謝籠中接取末次注射后第5、15、25天的12 h尿液，尿液樣品于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清液進UPLC-MS檢測。

1.5 檢測項目及方法

1.5.1 常規(guī)指標檢測

實驗過程中觀察大鼠的外觀行為變化，監(jiān)測體重，放免法檢測血清T3、T4、FT3、FT4、TSH的水平(委托黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院同位素放免室檢測)，HE染色檢查甲狀腺病理改變。

1.5.2 UPLC-MS檢測尿液代謝數(shù)據(jù)

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLCTMBEH C18column(50 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm，Waters Corp，Milford，USA)；流速0.40 mL/min；柱溫：25℃；樣品倉溫度：4℃；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件(表1)；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進行正離子掃描分析。

表1 UPLC梯度洗脫條件

1.5.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描檢測；毛細管電壓掃描為3000 V，樣本錐孔電壓為35 V；分離錐孔電壓為3.0 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350℃；準確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+=556.2771；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1500。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠外觀行為

優(yōu)甲樂模型：與空白組比較，模型組從第14天左右開始，出現(xiàn)煩躁不安、活動頻繁、飲水量多，鼠籠內(nèi)潮濕，排泄物增多，毛發(fā)無光澤；造模后一周基本恢復(fù)正常。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型：與空白組比較，模型組于造模后第5天開始，出現(xiàn)煩躁不安、活動頻繁、飲水量多，鼠籠內(nèi)潮濕，排泄物增多，毛發(fā)無光澤；至第25天時癥狀未見減輕。

2.2 體重

從表2可知，造模第1周，模型組體重出現(xiàn)負增長，與空白組比較有顯著的統(tǒng)計學意義，第2周、第3周，雖與空白組比較無統(tǒng)計學意義，但直觀數(shù)據(jù)觀察可看出增長緩慢，待到造模結(jié)束后2周，體重增長恢復(fù)到正常水平。

從表3可知，造模的前10 d模型組體重增長緩慢，與空白組比較有顯著性差異，第10～20天的時間段體重與空白組比較雖無統(tǒng)計學意義但增長緩慢，第20～30天的時間段體重差與空白組比較有統(tǒng)計學意義，第30天至實驗結(jié)束模型組體重增長恢復(fù)正常。

2.3 生化指標結(jié)果

從表4可知，造模后大鼠血清T3、T4、FT3、FT4與空白組比較均具有顯著性差異，恢復(fù)7 d的模型T3、T4、FT3、FT4均回到正常水平，而TSH與模型組比較無統(tǒng)計學意義。

表2 優(yōu)甲樂模型體重變化

表3 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型體重變化

表4 優(yōu)甲樂模型生化指標結(jié)果

表5 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型生化指標結(jié)果

從表5可知，造模后第15天時，模型組大鼠血清T3和T4與空白組比較有統(tǒng)計學意義，第25天時T3和T4與空白組比較仍有統(tǒng)計學意義，第25天時TSH與空白組比較有統(tǒng)計學意義。

2.4 病理

從彩插3圖1中可知，空白組甲狀腺濾泡大小基本一致, 呈圓形或橢圓形, 內(nèi)充深紅色染膠質(zhì), 濾泡膠質(zhì)染色均勻, 濾泡間質(zhì)無水腫, 上皮細胞無增生；優(yōu)甲樂模型組與空白組比較未見明顯改變，而小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型組，甲狀腺濾泡破壞, 組織有血管侵犯，上皮細胞脫落，增生，間有大量結(jié)締組織增生，少量的炎細胞存在。

2.5 代謝組學整體評價結(jié)果

大鼠尿液進UPLC-MS進行掃描檢測，12 min的BIP色譜圖顯示尿液樣品得到了良好的分離效果(圖2)，將各組的液相質(zhì)譜色譜圖利用MassLynxV4.1工作站進行PCA分析，得到反應(yīng)各組組間離散程度的Scores plot圖(圖3)。

圖2 大鼠尿液UPLC-MS檢測的BPI圖

注：A.優(yōu)甲樂模型B.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型。

從圖中可能看出，優(yōu)甲樂模型組造模后，模型組與空白組比較明顯的偏離空白組位置，表明造模后內(nèi)源性代謝發(fā)生非常明顯的改變，恢復(fù)期第7天時有回調(diào)的趨勢但仍然與空白組無交叉，而到14 d時在得分圖中與空白組重疊，表明模型基本恢復(fù)正常；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型，造模后第5天、15天和25天的代謝改變基本上一致，均與空白組無交叉，表明模型內(nèi)源性代謝被擾動并且保持在一定的狀態(tài)，說明此模型的持續(xù)性較好。

3 討論

復(fù)制甲亢動物模型的方法主要有以下幾種：(1)利用免疫方法構(gòu)建誘發(fā)性甲亢動物模型，基本方法[6]是利用表達TSHR的細胞或質(zhì)粒DNA或腺病毒免疫小鼠，此方法復(fù)制的甲亢動物模型成為當前研究甲亢發(fā)病機制的首選模型，但此種方法動物模型復(fù)制繁瑣，成模率不高；(2)利用外源性甲狀腺素刺激造成高甲狀腺素狀態(tài)動物模型，此模型是模擬臨床病癥的造模方法，不能作為病理機制研究的模型，但此模型的特點是簡單快速，成模率高，對于藥物療效的初步評價為首選模型。(3)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌免疫模型，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種常見的感染因素，相關(guān)研究[7-9]表明小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌感染與甲亢的病情和復(fù)發(fā)率關(guān)系密切，因此，利用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌尾靜脈免疫復(fù)制模擬甲亢發(fā)病機制的動物模型，成為當前較常用的甲亢動物模型。

對于評價和篩選治療甲亢的藥物及其療效，選擇和復(fù)制合適的甲亢動物模型至關(guān)重要，因此，本文選取了大鼠口服優(yōu)甲樂和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌尾靜脈免疫兩種甲亢動物模型進行對比研究，實驗結(jié)果表明，大鼠口服優(yōu)甲樂造模后，相關(guān)指標顯示，模型復(fù)制成功，但1周后模型恢復(fù)至正常水平，說明外源性給予甲狀腺素的模型不具有持續(xù)性，此模型的特點的簡單快速，成模率高。而尾靜脈注射小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌后，相關(guān)指標顯示模型復(fù)制成功，并且模型持續(xù)近1個月，這與臨床甲亢的病程較長類似，此模型的特點是復(fù)制較繁瑣，合適的菌液濃度及正規(guī)熟練的尾靜脈注射對于成模至關(guān)重要。

本文采用常規(guī)指標并結(jié)合整體代謝變化綜合評價了模型的成型性及持續(xù)性，優(yōu)甲樂模型為給予外源性甲狀腺激素造成高甲狀腺激素狀態(tài)，因此，此模型的病理指標改變明顯，并且代謝組學結(jié)果也顯示內(nèi)源性代謝的改變明顯，此模型成型性好但持續(xù)性差，對于藥物療效的初步評價為首選模型，但要預(yù)防給藥方能起到評價療效的效果；而小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌模型是模擬甲亢的發(fā)病機制，是通過注射細菌后免疫而產(chǎn)生甲亢，相關(guān)病理結(jié)果及代謝組學數(shù)據(jù)符合甲亢的臨床病理表現(xiàn)，雖不如優(yōu)甲樂模型相關(guān)指標改變明顯，但此模型持續(xù)性較好，用于評價藥物的療效可采用治療給藥的方式，即成模后再給藥治療，更符合臨床上用藥治療的規(guī)律，此模型亦可作為疾病機制研究的模型。

參考文獻：

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