惠恩健,葛爾寧,盛振華,黃 真
(浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)
動(dòng)物用爪掛杠持久度實(shí)驗(yàn)同屬于靜態(tài)抗疲勞實(shí)驗(yàn)[1],可用在抗疲勞、抗抑郁等藥物的研制及相關(guān)醫(yī)學(xué)研究中。當(dāng)動(dòng)物在一個(gè)封閉的水池中游泳時(shí),因恐懼或體力不支往往會(huì)尋找可以抓住的支撐點(diǎn),而當(dāng)四爪及臂不能支撐整個(gè)身體重量時(shí)又會(huì)放棄掛杠掉入水中,如此重復(fù)多次,最終放棄抓杠。掛杠時(shí)間和次數(shù)可用于評(píng)價(jià)研制藥物的藥效及相關(guān)醫(yī)學(xué)作用。
這種讓動(dòng)物自然抓杠掛臂的實(shí)驗(yàn)方式可用于動(dòng)物靜態(tài)疲勞的檢測(cè),采用該方法測(cè)試動(dòng)物抗疲勞能力目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道,類(lèi)似動(dòng)物抗疲勞實(shí)驗(yàn)?zāi)壳霸跇I(yè)界有采用站線式、站杠式[1]等方法, 對(duì)動(dòng)物來(lái)講,站立姿勢(shì)較易做到,持久度可較長(zhǎng),一次實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),有時(shí)需要24 h以上,本文所述方法與前兩種的不同在于:本研究以動(dòng)物多臂掛杠的姿勢(shì)進(jìn)行疲勞實(shí)驗(yàn),相比前者難度增加,持久度降低,相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短。實(shí)驗(yàn)常用動(dòng)物如小白鼠等的臂力有限,一次掛杠時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng),如此可在水面上方加一活動(dòng)細(xì)杠供其抓握,當(dāng)小鼠抓住細(xì)杠時(shí),讓水位迅速下降,此時(shí)小鼠不再具浮力,體重全由爪和掛臂支撐,最多幾分鐘就會(huì)掉回水中,這時(shí)再讓水位復(fù)位,如此重復(fù)可進(jìn)行相應(yīng)疲勞實(shí)驗(yàn),相關(guān)自動(dòng)檢測(cè)裝置可據(jù)此原理研制[1-3]。
ICR小鼠28只,雌雄各半,體重15~25 g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】。浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物【SYXK(浙)2013-0184】,10 L娃哈哈桶裝純凈水,購(gòu)自杭州市玲玲飲用水商行(生產(chǎn)許可證編號(hào):QS330006010302)。
該裝置整體構(gòu)思和設(shè)計(jì)共分水池、傳感部分、系統(tǒng)控制硬件、系統(tǒng)控制軟件、面板按鈕功能等5部分(圖1):
注:1. 實(shí)驗(yàn)水槽; 2. 蓄水池; 3. 溫控器; 4. 潛水泵; 5. 電水閥; 6. 彈簧; 7. 光欄; 8. 光耦; 9. 橫杠; 10. 蓋板; 11. 可控出水口; 12. 進(jìn)水口; 13. 出水口; 14. 隔板A; 15. 隔板B; 16. 隔板C; 17. 活動(dòng)蓋; 18. 控制器。
1.2.1 水池
水池由水槽1和蓄水池2兩部分組成,1尺寸為:高15 cm×長(zhǎng)15 cm×寬8 cm,上有一8×7 cm2的活動(dòng)蓋17,可供40~15 g重的小動(dòng)物進(jìn)出,下端開(kāi)有3個(gè)進(jìn)出水孔,11為可控出水口,由控制器18經(jīng)電水閥5控制,12為進(jìn)水口,由潛水泵4把2中的恒溫水不停注入1中,13為出水口,當(dāng)1中水位滿(mǎn)過(guò)隔板C 16時(shí),由該出水口排入2,隔板A 14的作用是當(dāng)5打開(kāi),1水位下降時(shí),保持1中水位不低于14高度(出水口出水速度遠(yuǎn)高于進(jìn)水速度),隔板B 15可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與進(jìn)出水口隔離。
蓄水池2體積2倍于1,內(nèi)置可調(diào)溫控器3和潛水泵4。如圖1, 4把2中的恒溫水恒流注入1,當(dāng)5關(guān)閉時(shí),1中水位如滿(mǎn)過(guò)16,可經(jīng)13排回2,如此,可保持1中水位相對(duì)高位,實(shí)際設(shè)定高度為離橫杠9約1.2 cm距離。當(dāng)5打開(kāi)時(shí),1中水位如滿(mǎn)過(guò)14,即可經(jīng)11排回2,如此,可保持1中水位相對(duì)低位。
1.2.2 傳感部分
兩對(duì)光耦8分別安裝在上端蓋板10的窄相兩端,見(jiàn)圖1右上,彈簧6使8處常開(kāi)狀態(tài),當(dāng)動(dòng)物下拉橫杠9時(shí),帶動(dòng)光欄7下移,8輸出信號(hào)改變,釋放9時(shí),7上移,8輸出信號(hào)復(fù)原。在9上方的蓋板部位安裝一排LED燈,位置與橫杠平行,用磨砂玻璃蓋住形成無(wú)影光帶,便于動(dòng)物尋找橫杠。
1.2.3 系統(tǒng)控制硬件
由常用51系列單片機(jī)AT89S51為主控芯片加TTL功能電路和模擬放大電路等組成的復(fù)合控制器來(lái)控制光耦信號(hào)的接收、電水閥的開(kāi)關(guān)并顯示來(lái)自動(dòng)物掛杠行為的實(shí)驗(yàn)信息??刂圃砜驁D見(jiàn)圖2,具體電路線路圖在此略去。
圖2 電路控制原理框圖
1.2.4 系統(tǒng)控制軟件
系統(tǒng)軟件主流程如圖3所示,具體程序在此略去。
圖3 系統(tǒng)軟件流程
1.2.5 面板按鈕功能
為簡(jiǎn)易操作,面板僅設(shè)上下兩排4位LED顯示(實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)顯示為上排右2位,查詢(xún)序號(hào)顯示為上排左2位,計(jì)時(shí)顯示為下排4位)、控制器電源開(kāi)關(guān)、查詢(xún)按鈕和清零按鈕。
1.3.1 設(shè)置溫控器溫度,用純凈水加滿(mǎn)儲(chǔ)水箱,預(yù)熱至設(shè)定溫度后開(kāi)啟控制器電源開(kāi)關(guān),此時(shí)計(jì)數(shù)和計(jì)時(shí)顯示自動(dòng)清零,等待光耦信號(hào)到來(lái);潛水泵把儲(chǔ)水箱中清水源源注入實(shí)驗(yàn)水槽。待水位滿(mǎn)過(guò)隔板C 后,取小鼠,打開(kāi)活動(dòng)蓋放入水槽中,蓋上活動(dòng)蓋,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。觀察小鼠在光壁的水槽中來(lái)回游水,最終會(huì)因恐懼或疲勞去抓水槽中唯一可支撐物橫杠,微小的負(fù)荷即可使橫杠下移,同時(shí)帶動(dòng)光欄下移使光耦產(chǎn)生“閉”信號(hào)(橫杠的兩端都有光耦,兩光耦信號(hào)以“或”門(mén)輸出。),該信號(hào)經(jīng)控制器使計(jì)數(shù)顯示累加1,并開(kāi)始相應(yīng)計(jì)時(shí),同時(shí)讓電水閥打開(kāi),槽中水位迅速下降至隔板A 位,此時(shí),小鼠處于無(wú)浮力狀況下掛杠支撐,直至爪力或臂力不支掉入水中,同時(shí)橫杠在彈簧的作用下和光欄同步上移,光耦產(chǎn)生“開(kāi)”信號(hào),并使電水閥關(guān)閉,槽中水緩緩上升至隔板C位。至此,一次計(jì)數(shù)計(jì)時(shí)過(guò)程結(jié)束,控制器等待下一“閉”信號(hào)的到來(lái),如此多次循環(huán),直至小鼠放棄抓杠。
1.3.2 按“查詢(xún)”鈕,上排左兩位顯示掛杠次序,下排4位顯示相應(yīng)的持久時(shí)間,按次序循環(huán)顯示,按一次顯示一組。計(jì)數(shù)最多可達(dá)35次,一次計(jì)時(shí)最長(zhǎng)可達(dá)9999 s。
1.3.3 按“清零”鈕,所有信息清零,等待下一個(gè)“閉”信號(hào)的到來(lái)。
28只小鼠共分A、B兩組,每組14只,雌雄各半,A組正常飼養(yǎng),B組實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h。按1.3項(xiàng)所述操作,儀器將根據(jù)小白鼠的掛杠次數(shù)和相應(yīng)掛杠持久時(shí)間自動(dòng)記錄,一只小鼠的實(shí)驗(yàn)時(shí)間可根據(jù)小鼠的體能及是否愿意多次掛杠來(lái)定,一只正常的小鼠一次實(shí)驗(yàn)會(huì)有5~10次掛杠,體力差的不超過(guò)5次就不再愿意抓杠。由上述實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定A、B兩組小鼠的掛杠次數(shù)和相應(yīng)的掛杠持久時(shí)間。
2.1 以柱狀圖的形式來(lái)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,見(jiàn)圖4:黑柱表示A組14例小鼠在各次掛杠時(shí)的持久時(shí)間平均值,白柱表示B組14例小鼠在各次掛杠時(shí)的持久時(shí)間平均值,橫坐標(biāo)為掛杠次序,縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)各次掛杠時(shí)的持久時(shí)間。
注:■:A組; □:B組。
2.2 表1所列為2組小鼠掛杠次數(shù)和掛杠持久時(shí)間總和的平均值,由表1可知,禁食組平均掛杠次數(shù)、掛杠持久時(shí)間總和與正常組比較,均具有顯著性差異(P< 0.05)。
表1 禁食對(duì)小鼠掛杠次數(shù)和持久時(shí)間的影響(n=14)
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,兩組小鼠的平均掛杠次數(shù)和相應(yīng)掛杠持久時(shí)間差異明顯,充分說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法及裝置在動(dòng)物抗疲勞測(cè)試實(shí)驗(yàn)中的適用性。
本文采用51系列單片微機(jī)控制和記憶系統(tǒng)結(jié)合光耦傳感器、電控水閥等組合控制電路[4~7],研制了一種能自動(dòng)記錄小鼠在該實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的掛杠次數(shù)及掛杠持久時(shí)間的裝置。研制思路和檢測(cè)方式具一定的創(chuàng)新性和先進(jìn)性。作為該領(lǐng)域中的一種全新實(shí)驗(yàn)方法和理念,配以自動(dòng)化檢測(cè)手段,在業(yè)界可得到推廣應(yīng)用。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),掛杠式動(dòng)物抗疲勞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短,實(shí)驗(yàn)觀察小鼠一次掛杠時(shí)間不超過(guò)3 min。經(jīng)多次抓杠掛杠后最終放棄抓杠,所以,一只小鼠的實(shí)驗(yàn)時(shí)間一般不超出2 h。
相對(duì)較冷的環(huán)境更適合該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,曾經(jīng)試過(guò)在26℃以上的水溫和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行該實(shí)驗(yàn),結(jié)果效果不佳,原因是由于實(shí)驗(yàn)小鼠在一個(gè)較溫和的水環(huán)境中游水會(huì)感到相對(duì)悠閑,緊張和恐懼度不高,抓杠的意愿較弱,有時(shí)幾小時(shí)都不會(huì)去抓杠,如此,不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,22 ℃左右較合適。
該實(shí)驗(yàn)不宜選擇太小的動(dòng)物,如小于15 g的小白鼠,由于浮力的因素使小鼠掛杠時(shí)重力太小,帶不動(dòng)光欄下移,無(wú)法產(chǎn)生有效信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)幾次掛杠后,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一抓杠就放棄的干擾動(dòng)作,查詢(xún)結(jié)果時(shí)如某次掛杠的對(duì)應(yīng)時(shí)間為零,可視為一次誤操作。
本裝置需在相對(duì)平靜平穩(wěn)的環(huán)境下工作,震蕩和過(guò)度傾斜會(huì)使水平面不穩(wěn),影響實(shí)驗(yàn)效果。在沒(méi)有意外情況干擾的前提下(如斷電等),儀器可連續(xù)工作48 h。
參考文獻(xiàn):
[1] 葛爾寧,袁勇,應(yīng)華忠等.數(shù)據(jù)記憶動(dòng)物疲勞測(cè)試儀的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(8):489-490.
[2] 葛爾寧,黃真.頭部位移檢測(cè)法動(dòng)物懸尾實(shí)驗(yàn)儀的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(8):58-61.
[3] 李萍,張池,張勃. AT89S51單片機(jī)原理、開(kāi)發(fā)與應(yīng)用實(shí)例[M].北京:中國(guó)電力出版社,2008.1-150.
[4] 葛爾寧.數(shù)據(jù)記憶動(dòng)物游泳測(cè)試儀的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(2):71-73.
[5] 余文芳,葛爾寧.微機(jī)控制自動(dòng)微容量測(cè)試儀的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(6):76-78.
[6] 袁勇,葛爾寧.微機(jī)自動(dòng)控制動(dòng)物飲食行為檢測(cè)儀的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(9):75-78.
[7] 余永權(quán),汪明慧,黃英.單片機(jī)在控制系統(tǒng)中的應(yīng)用[M].北京:電子工業(yè)出版社,2005.125-278.