那達(dá)翔，馬 壯，羅 陽，李 琦，譚偉峰，王蘭蘭，張國英，尹 昂，黃 河，吳曉彤，王 露

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京大學(xué)人類疾病基因研究中心，北京 100191)

C1qTNF相關(guān)蛋白(C1qTNF-related protein，CTRP)隸屬脂肪細(xì)胞因子家族，現(xiàn)已確定這個(gè)家族有15個(gè)成員[1]。其中的脂聯(lián)素已經(jīng)具有將近20年的研究歷史，在肥胖、II型糖尿病發(fā)生、胰島素抑制，以及在由肥胖引起的慢性炎癥發(fā)生過程中具有重要的作用[2]，目前研究發(fā)現(xiàn)，在代謝與炎癥的交叉領(lǐng)域中，CTRP家族發(fā)揮了非常重要的作用[1]。

CTRP4(C1q TNF-related protein 4)是CTRP脂肪細(xì)胞因子家族成員之一，由本室與國家基因組北方中心利用反向生物學(xué)的方法，通過DLR(dual luciferase report assay)平臺(tái)篩選出的對NF-κB通路具有明顯活化作用的一個(gè)功能未知的新基因。我們于2011年首次在國際上進(jìn)行了報(bào)道。前期的研究發(fā)現(xiàn)人CTRP4重組蛋白在肝癌細(xì)胞系HepG2中可以上調(diào)IL-6、TNFα的表達(dá)，促進(jìn)STAT3的磷酸化。還可以提高HepG2對化療藥的抵抗，促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成[3]。

我們體外研究已經(jīng)證明CTRP4具有多種重要功能，進(jìn)一步研究該分子在體內(nèi)的生理功能及病理作用是十分必要的。為了更深入研究CTRP4體內(nèi)的作用和機(jī)制，我們構(gòu)建了人CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠，并進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建是成功的。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

CTRP4的轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所【SCXK(京)2009-0004】。小鼠品系：C57BL/6J，使用級(jí)別為SPF級(jí)。用于交配的C57BL/6J小鼠均購自維通利華公司【SCXK(京)2011-0012】，遺傳背景為表面分子CD45.2陽性。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級(jí)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部【SYXK(京)2011-0039】。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶XbaI、XhoI等購自TaKaRa 公司，KpnI等購自NEB公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas 公司；基因特異性引物由北京擎科生物公司合成；硝酸纖維素膜(NC 膜)購自Amersham-Pharmacia biotech 公司；IRDTMye 800-偶聯(lián)的抗鼠或抗兔的IgG 二抗購自 LICOR Bioscience 公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳Marker 購自Fermentas；2TAQ PCR MASTERMIX 購自博邁德公司；RIPA 裂解液、PMSF購自碧云天公司；鼠尾裂解液配方：1 mol/L Tris-HCl 5 mL；0.5 mol/L EDTA 2.5 mL；NaCl 5.844 g；10%SDS 25 mL。

1.3 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CTRP4-Myc/His由本室構(gòu)建，pCAGGS質(zhì)粒由美國Vanderbilt大學(xué)吳冠青教授饋贈(zèng)?？寺》桨钢校舷掠我锞唧w序列分別為：

CTRP4-PCAGGS-F: 5’-CCGCTCGAGATGCTGC CGCTTCTGCT-3’；

CTRP4-PCAGGS-R: 5’-CCGCTCGAGTCAATGA TGATGATGATG-3’。

1.4 轉(zhuǎn)基因鼠的制備：

選用性成熟的野生型C57BL/6J雌性小鼠。腹腔依次注射孕馬血清(50 U/mL，0.1 mL)及人絨毛膜促性腺激素(50 U/mL，0.1 mL)，置于單籠飼養(yǎng)的正常雄性小鼠籠內(nèi)，取有精栓雌性小鼠輸卵管。受精卵置顯微鏡注射平臺(tái)M2液滴內(nèi)，選有原核的受精卵為注射對象，用顯微鏡操作儀將有目的基因的線性化片段注入小鼠受精卵雄性原核中，再移植到6周齡ICR孕母鼠輸卵管中，待其發(fā)育后產(chǎn)仔。此項(xiàng)工作由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所完成。

1.5 鼠尾基因組DNA提取

剪取鼠尾0.5 cm左右，用500 μL含有0.1 mg/mL蛋白酶K的鼠尾裂解液55℃裂解過夜，之后加入300 μL飽和NaCl冰浴15 min，12000 r/min轉(zhuǎn)速室溫離心15 min，收上清后加入700 μL異丙醇顛倒混勻直至形成絮狀沉淀，12000 r/min室溫離心15 min后棄上清加入70%乙醇洗滌沉淀，棄乙醇，晾干。50 μL水65℃溶解沉淀得鼠尾基因組DNA。

1.6 PCR鑒定CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠

以2.5中所述提取的鼠尾基因組DNA為模板，利用pCAGGS載體的啟動(dòng)子序列chicken β-actin的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在10 μL PCR體系中加入：2×PCR Mix 5 μL，ddH2O 4 μL，PCR上下游引物各0.2 μL，模板DNA 0.6 μL。反應(yīng)條件為：94℃變性5 min，進(jìn)入循環(huán)(94℃變性30 s，退火58℃，30 s，延伸72℃，30 s)。共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)在72℃延伸10 min，4℃保存。上游引物為：5’-CCCATAGTAACGCCAATAGG-3’；下游引物為5’-GGGAGAGTGAAGCAGAACG-3’。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 轉(zhuǎn)基因小鼠各個(gè)組織蛋白的提取

分離小鼠各器官組織，每種組織取100 mg，用500 μL的RIPA裂解液勻漿20 s后冰上裂解30 min，隨后4℃離心，12000 r/min，20 min，吸取上清，BCA定量法對裂解液進(jìn)行蛋白定量。

1.8 western blot檢測CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠各個(gè)組織的表達(dá)

收集上一步的組織勻漿液上清，加入SDS加樣緩沖液，99℃加熱10 min，經(jīng)12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離蛋白樣品后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上， 5%脫脂牛奶封閉2 h后，用TBS-T以1∶800比例配置CTRP4一抗，將膜與抗體封入雜交袋中，4℃過夜，之后用TBS-T洗膜三次，每次10 min，再加入相應(yīng)的IRDyeTM 800/700標(biāo)記的二抗避光反應(yīng)1 h，TBS-T重復(fù)洗膜三次，最后用Odyssey Imaging System儀器掃描成像分析。

1.9 CTRP4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖及純合子篩選

1.9.1 轉(zhuǎn)基因小鼠F1代的繁殖

圖1 pCAGGS-CTRP4質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

我們將CTRP4轉(zhuǎn)基因鼠首建鼠(Founder)(雄性5只，雌性8只)分別與育齡期的野生型C57BL/6J小鼠交配，交配大約兩周之后觀測小鼠腹部并用指揉法判斷小鼠的胚胎情況，如果證實(shí)確已受孕，即把雌鼠分籠。小鼠一代生育的子鼠在6～12只左右，在F1代小鼠出生12 d左右對小鼠編號(hào)并鑒定小鼠的基因型，得到CTRP4雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠，在4周時(shí)將新生小鼠離乳。

1.9.2 F2代轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育

用F1代鑒定陽性的CTRP4雜合子小鼠進(jìn)行近親交配，即同窩陽性小鼠的雌雄交配，根據(jù)最適的雌雄比例(雄:雌=1:2)進(jìn)行，編號(hào)及鑒定方法同F(xiàn)1代。

1.9.3 F2轉(zhuǎn)基因純合子小鼠的篩選

根據(jù)孟德爾遺傳定律，F(xiàn)2代小鼠中有一定概率出現(xiàn)純合子，因此通過測交的方法來篩選F2代中的純合子小鼠，即把得到的每一只CTRP4陽性F2代小鼠與野生型的C57BL/6J小鼠進(jìn)行交配，通過子代小鼠判斷F2代小鼠是否為純合子，如果子代小鼠經(jīng)過PCR鑒定100%為CTRP4陽性，則表明親代小鼠為純合子小鼠，否則為雜合子小鼠。PCR鑒定方法同1.6中所述。

陰性鼠的來源：F1代小鼠中的陰性小鼠進(jìn)行交配，并大量繁殖，進(jìn)而得到用于實(shí)驗(yàn)對照的陰性小鼠。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

以1.3中所述真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CTRP4-Myc/His為模板，以pCAGGS質(zhì)粒為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建，pCAGGS-CTRP4質(zhì)粒的構(gòu)建方案基本過程如下：設(shè)計(jì)包含Xho1酶切序列的CTRP4 基因特異性引物(即如1.3中所述引物)，以pcDNA3.1-CTRP4-Myc/HisB(-)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到的片段連同真核表達(dá)載體pCAGGS 采用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切膠回收目的條帶?；厥盏妮d體和PCR 片段用T4 DNA 連接酶連接，16℃，12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-BLUE 中，使用LA(Amp 抗性)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)14～16 h，挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。鑒定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。對符合目的要求的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與NCBI 標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中的CTRP4 CDS 序列進(jìn)行比對，準(zhǔn)確無誤后進(jìn)行質(zhì)粒大量提取，最終所得質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示。質(zhì)粒線性化，定量除菌后提供給中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制作轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖與鑒定

通過首建鼠和野生型C57BL/6J小鼠交配，得到F1代小鼠135只，經(jīng)觀察雌雄比例并沒有異常，通過1.5和1.6中所述鑒定方法對F1代小鼠進(jìn)行鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，最終鑒定有30只陽性小鼠。以首建鼠66號(hào)為例。如圖1A所示，66號(hào)小鼠所生子代(F1代)12只小鼠的PCR鑒定結(jié)果顯示，1號(hào)和6號(hào)為陽性鼠。

隨后我們選擇F1代小鼠同窩并且至少有1只雄性，1只雌性的小鼠進(jìn)行同窩交配，最終我們篩選出4窩小鼠進(jìn)行繁殖，以其中一窩F1代小鼠為例，如圖1B所示，其生產(chǎn)的7只小鼠中1號(hào)和6號(hào)為陽性。

經(jīng)過上述繁殖我們總共獲得28只陽性F2代小鼠。通過1.9.3中所述測交方法鑒定，得到兩個(gè)品系純合子轉(zhuǎn)基因小鼠共8只。以其中一系純合子小鼠鑒定結(jié)果為例，圖1C中所示結(jié)果，F(xiàn)2代4號(hào)小鼠與野生型小鼠交配生成的7只F3代小鼠均為陽性，證實(shí)該轉(zhuǎn)基因小鼠為純合子。

2.3 CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)的鑒定

為了驗(yàn)證外源CTRP4在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平，我們?nèi)TRP4 純合子小鼠的心臟，肝，腦，腎等組織進(jìn)行勻漿處理后western blot檢測CTRP4表達(dá)水平，同時(shí)取同窩陰性小鼠相應(yīng)組織作對照，CTRP4純合子小鼠表達(dá)水平在各組織中明顯高于同窩陰性小鼠，結(jié)果如圖3所示：

注： A: M:DS2000 Marker， 1-12：轉(zhuǎn)基因小鼠，N：陰性對照；B: M:DS2000 Marker，1-7：轉(zhuǎn)基因小鼠，N：陰性對照 C: M:DS2000 Marker，1-7：轉(zhuǎn)基因小鼠，N：陰性對照。

注：TG：CTRP4純合子小鼠，WT：F2代同窩陰性小鼠 Heart: 心臟，Liver：肝臟，Brain：腦，Kidney：腎臟。

表1CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠血生化分析結(jié)果

Tab.1Blood chemistry analysis of CTRP4 transgenic mice

2.4 CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠血生化分析結(jié)果

CTRP4作為潛在的脂肪因子，很可能對機(jī)體的血糖血脂等具有調(diào)控作用。為了驗(yàn)證這種猜測，我們對CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了血生化檢測，包括血糖，膽固醇和甘油三酯三項(xiàng)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)血清膽固醇和血糖水平相對較低，如表1所示。

2.5 CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠體重曲線，脂肪比例與脂肪形態(tài)(彩插1圖4)

CTRP家族成員中有半數(shù)以上是脂肪因子，根據(jù)目前研究表明，脂肪因子有可能對機(jī)體體重、脂肪組織占體重比例以及脂肪細(xì)胞大小發(fā)揮一定的影響。為了檢測CTRP4是否具有類似的作用，我們檢測了CTRP4轉(zhuǎn)基因小鼠自出生后16周的體重變化(圖4A)，同時(shí)測量了其脂肪比例(圖4B)，觀察了脂肪HE染色結(jié)果(圖4C)。在正常飲食條件下，上述指標(biāo)均沒有明顯變化。

3 討論

脂肪細(xì)胞因子是一類在肥胖和由肥胖誘導(dǎo)的慢性炎癥過程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子[2]，通過對代謝調(diào)控通路、炎癥信號(hào)通路、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等進(jìn)行調(diào)節(jié)，在多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。近20年來，脂肪因子越來越受到人們的關(guān)注，通過對脂肪因子的研究，人們逐漸對代謝的調(diào)節(jié)、肥胖、II型糖尿病、炎癥的關(guān)系有了更深一步的認(rèn)識(shí)。

CTRP家族是目前脂肪因子研究領(lǐng)域中被廣泛關(guān)注的一類分子，包括脂聯(lián)素在內(nèi)已有16個(gè)成員被發(fā)現(xiàn)，其中大部分成員均已有功能研究報(bào)道[4-8]，脂聯(lián)素在肥胖，胰島素抵抗和由肥胖介導(dǎo)的慢性炎癥過程中的重要作用已經(jīng)被確認(rèn)。該家族主要特征是具有N端膠原樣結(jié)構(gòu)域和C端C1q球狀結(jié)構(gòu)域[5]。CTRP4是該家族中較為特殊的一個(gè)成員，它并不具有N端膠原樣結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，它是唯一一個(gè)具有兩個(gè)C1q結(jié)構(gòu)域的成員[3]。這一結(jié)構(gòu)上的特殊性也提示我們，CTRP4在該家族中或許有較為特殊的地位。

NF-κB在細(xì)胞炎癥信號(hào)的誘發(fā)和調(diào)節(jié)中具有核心作用[9]。在固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原模式分子后NF-κB在巨噬細(xì)胞中的活化可以啟動(dòng)下游一系列的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10-12]。NF-κB可以對炎癥過程進(jìn)行調(diào)控，研究已經(jīng)證明肥胖與炎癥的關(guān)系非常密切[13]。我們前期的研究表明CTRP4在NF-κB信號(hào)通路中可能具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此對CTRP4進(jìn)行深入研究對于闡釋炎癥、肥胖以及NF-κB信號(hào)通路都具有非常重要的意義。

本文共獲得了兩系CTRP4轉(zhuǎn)基因純合子小鼠，通過在mRNA和蛋白水平的鑒定，證明其在全身多種組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建是成功的。這為我們對CTRP4的體內(nèi)功能和機(jī)制研究提供了有力的工具。

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