陳德鳳，齊魯楠，彭 濤，羅國容，黎樂群△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一［1］，其發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢，2007年衛(wèi)生部統(tǒng)計肝癌死因位于惡性腫瘤死因的第二位，并且乙型肝炎病毒（HBV）的高感染率和黃曲霉毒素B1（AFB1）的高暴露是原發(fā)性肝癌高發(fā)的主要因素 之一［2－3］。有研究表 明［4］，βcatenin基因突變與肝癌發(fā)生有關(guān)，而HBV與AFB1的高暴露均能夠?qū)е娄拢璫atenin基因的突變并同時影響β－catenin蛋白的磷酸化。9.5%肝癌患者抑癌基因第10號染色體缺失與PTEN基因存在第4、5和8外顯子的突變［5］。肝癌的發(fā)生是一個多基因和多步驟的過程，肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中HBV與AFB1可能共同作用促使β－catenin基因和PTEN基因發(fā)生改變，為探索HBV和AFB1不同暴露情況下β－catenin基因和PTEN基因mRNA表達(dá)與HCC的關(guān)系，本研究運用逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）法從基因水平檢測β－catenin和PTEN 基因表達(dá)情況，為HBV及AFB1高暴露的地區(qū)開展HCC的預(yù)防和早期診療研究提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 108例HCC組織標(biāo)本收集于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一附屬醫(yī)院肝膽外科和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的標(biāo)本庫，標(biāo)本時間為2008年5月至2010年7月，同時設(shè)正常對照組20例，取自正常肝組織標(biāo)本，主要為肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體標(biāo)本。手術(shù)標(biāo)本的病例包括男95例，女13例；年齡28～78歲，平均48.6歲；肝癌直徑為2.0～16.5cm，平均6.8cm。HBV暴露陽性標(biāo)準(zhǔn)為血清中HBsAg（＋），AFB1暴露標(biāo)準(zhǔn)為癌組織中AFB1－DNA加合物免疫組織化學(xué)陽性［6］。根據(jù)上述檢測結(jié)果以及研究目的，108例HCC患者根據(jù)HBV與 AFB1的暴露情況，分為4組，A組：HBV（＋）／AFB1（＋）48例；B組：HBV（＋）／AFB1（－）27例；C 組：HBV（－）／AFB1（＋）19例；D組：HBV（－）／AFB1（－）14例。所有患者術(shù)前均未接受放化療處理，術(shù)后病理診斷均證實為HCC，所有選取的病例均履行告知義務(wù)并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 AFB1－DNA加合物檢測方法 免疫組織化學(xué)染色：參照Santella等［7］的染色步驟。需同時設(shè)立陽性和陰性對照（對照組的大鼠肝組織均由美國哥倫比亞大學(xué)Regina M.Santella教授惠贈）。陽性對照取1年雄性SD大鼠行腹腔注射AFB11.0mg／kg和2.5mg／kg劑量，2h后處死取大鼠肝組織，未行腹腔注射AFB1的大鼠肝組織作為陰性對照。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后在顯微鏡下觀察，陽性定義標(biāo)準(zhǔn)為切片背景清晰同時肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紫黑色點狀顆粒。陰性定義標(biāo)準(zhǔn)為在肝細(xì)胞核內(nèi)無紫黑色點狀顆粒。

1.2.2 RT－PCR法檢測β－catenin與PTEN 基因的表達(dá)

1.2.2.1 癌組織總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 以Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測OD值，計算RNA含量和純度。用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.2 PCR引物的設(shè)計與合成 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。根據(jù)Genebank中公布的人β－catenin基因、PTEN 和GAPDH 基因的 mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物設(shè)計軟件進(jìn)行設(shè)計，并使用BLAST驗證為基因的特異性引物（各基因的正義引物和反義引物序列均跨至少一個內(nèi)含子）。

1.2.2.3 PCR反應(yīng)條件 將各試劑按順序加入到PCR反應(yīng)管中并混合后分裝，每管的總反應(yīng)體系為25μL。所用試劑為北京天根公司2×Tap PCR MasterMix，包括：2×MasterMix 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板10～100ng，滅菌雙蒸水補至25μL。反應(yīng)條件：β－catenin 基因：95℃預(yù)變性5 min；變性95℃30s，退火54℃40s，延伸72℃40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PTEN基因：95℃預(yù)變性5min；變性95℃30s，退火57℃40s，延伸72℃40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。GAPDH基因反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；變性95℃30s，退火55℃40s，延伸72℃40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。以上反應(yīng)均終止于4℃。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物分析 將PCR產(chǎn)物電泳后的凝膠置于分析儀觀察，同時拍下圖片進(jìn)行分析。圖片結(jié)果采用Quantity One軟件分析基因的灰度值，平均灰度值減去背景灰度值之差為統(tǒng)計分析數(shù)值，β－catenin基因與PTEN 基因的統(tǒng)計值為其灰度值與GAPDH 灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料的各組間均數(shù)比較，符合正態(tài)分布采用方差分析或成組設(shè)計兩樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β－catenin基因mRNA的表達(dá)情況 RT－PCR結(jié)果顯示，β－catenin基因mRNA的平均半定量灰度值A(chǔ)組、C組分別與D組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，4個亞組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1、圖1。

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與C組比較；d：P＜0.05，與D組比較。

48 1.13±0.14 B組 27 1.06±0.12 C組 19 1.16±0.18 D組 14 1.01±0.13ac正常對照組 20 0.85±0.13灰度值A(chǔ)組組別 n abcd

圖1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值

2.2 PTEN基因mRNA的表達(dá)情況 RT－PCR的結(jié)果顯示，PTEN基因mRNA的平均半定量灰度值A(chǔ)組與C組及B組與D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，A、B、D組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與D組比較。

48 0.54±0.13 B組 27 0.59±0.16 C組 19 0.97±0.16ab D組 14 0.92±0.13ab正常對照組 20 1.10±0.16灰度值A(chǔ)組組別 n abc

圖2 各組PTENmRNA半定量灰度值

3 討 論

本研究結(jié)果提示，β－catenin基因的高表達(dá)率可能與AFB1高暴露有關(guān)。AFT是寄生曲霉、黃曲霉等真菌的代謝產(chǎn)物，根據(jù)其細(xì)微結(jié)構(gòu)的不同可分為B1、B2、G1、G2、M1、M2等多種化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，在環(huán)境中廣泛存在，尤其在高溫潮濕地區(qū)的霉變食品中［8］。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1的毒性最強(qiáng)且對肝的致癌性最大［9］。AFB1致癌的可能機(jī)制是DNA損傷引起抑癌基因p53和癌基因ras突變，DNA損傷后DNA上出現(xiàn)堿基突變或堿基空缺，使p53的DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程受阻［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)AFB1高暴露組的β－catenin基因表達(dá)率顯著高于其他各組，C組的表達(dá)趨勢高于B組，作為單獨因素存在時，AFB1的效應(yīng)要高于 HBV，而β－catenin表達(dá)在A組中最高，則提示當(dāng)兩種因素同時存在時，對β－catenin表達(dá)可能具有協(xié)同效應(yīng)。Tien等［11］的研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞高及中分化的HCC中β－catenin 顯著增高，與本研究結(jié)果一致。Wnt／β－catenin 信號通路與腫瘤形成有關(guān)，通過轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾激活靶基因啟動肝癌再生程序［12－13］。β－catenin 基因的高表達(dá)率可能是β－catenin在細(xì)胞膜的積聚影響細(xì)胞間的黏附，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展。

在本研究中，在HBV高感染組中，PTEN基因的mRNA表達(dá)半定量灰度值低于其他各組，提示PTEN基因失活與HBV高感染率有關(guān)。PTEN是繼p53及Rb之后發(fā)現(xiàn)的重要抑癌基因，在多種惡性腫瘤中存在此基因表達(dá)降低［14－15］，PTEN在細(xì)胞內(nèi)的主要作用機(jī)制是影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平，通過其脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶發(fā)揮作用，PTEN低表達(dá)促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究中運用RT－PCR技術(shù)檢測PTENmRNA表達(dá)的半定量灰度值在A組與B組中要顯著低于C組與D組。而前兩組的共同點均為HBV感染陽性。由此本研究推斷HBV的感染是導(dǎo)致PTEN基因失活的因素之一，HBV的影響途徑可能是通過引起PTEN的缺失來降低PTEN基因的表達(dá)。HBV／AFB1雙暴露的HCC中，PTEN的表達(dá)水平明顯下降，推斷與HBV和AFB1具有協(xié)同作用有關(guān)，而PTEN基因的表達(dá)下調(diào)則可能主要與HBV感染有關(guān)，AFB1對PTEN基因的表達(dá)下調(diào)可能有輔助協(xié)同作用。

［1］Seeff LB，Hoofnagle JH.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in areas of low hepatitis B and hepatitis C endemicity［J］.Oncogene，2006，25（27）：3771－3777.

［2］Murakami Y，Saigo K，Takashima H，et al.Large scaled analysis of hepatitis B virus（HBV）DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas［J］.Gut，2005，54（8）：1162－1168.

［3］Smela ME，Hamm ML，Henderson PT，et al.The aflatoxin B（1）formamidopyrimidine adduct plays a major role in causing the types of mutations observed in human hepatocellular carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（10）：6655－6660.

［4］Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN，et al.Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，48（19）：2047－2063.

［5］郭雙平，王麗，王文亮，等.抑癌基因PTEN在肝癌組織中的突變及其對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用［J］.中華病理學(xué)雜志，2006，35（8）：467－472.

［6］Denissenko MF，Cahill J，Koudriakova TB，et al.Quantitation and mapping of aflatoxin B1－induced DNA damage in genomic DNA using aflatoxin B1－8，9－epoxide and microsomal activation systems［J］.Mutat Res，1999，425（2）：205－211.

［7］Santella RM，Zhang YJ，Chen CJ，et al.Immunohistochemical detection of aflatox in B1－DNA adducts and hepatitis B virus antigens in hepatocellular carcinoma and nontumorous liver tissue［J］.Environ Health Perspect，1993，99：199－202.

［8］陸建華，陸衛(wèi)中，陳建國.黃曲霉毒素檢測方法及其應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)實踐雜志，2005，4（3）：1411.

［9］Guengerich FP，Johnson WW，Shimada T，et al.Activation and detoxication of aflatoxin B1［J］.Mutat Res，1998，402（1／2）：121－128.

［10］蒿艷蓉，蘇建家.黃曲霉毒素B1（AFB1）體內(nèi)代謝研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，6（1）：146－149.

［11］Tien LT，Ito M，Nakao M.et al.Expression of beta－catenin in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11（16）：2398－2401.

［12］Nejak－Bowen KN，Monga SP.Beta－catenin signaling，liver regeneration and hepatocellular cancer：sorting the good from the bad［J］.Semin Cancer Biol，2011，21（1）：44－58.

［13］鄭勤，徐瀚峰.Wnt／β－catenin信號通路在肝癌中的研究進(jìn)展［J］.國際消化病雜志，2010，30（2）：76－78.

［14］謝智惠，王蕾，陳進(jìn)，等.Cyclin E、p53與PTEN在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（35）：3710－3712.

［15］Bignell GR，Greenman CD，Davies H，et al.Signatures of mutation and selection in the cancer genome［J］.Nature，2010，463（7283）：893－898.