馬振華 鄒春燕

幽門螺桿菌(HP)感染在慢性活動性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等各種胃腸道疾病中是一個至關(guān)重要的致病因素[1]。目前,我國是HP感染率及胃癌的發(fā)病率最高的國家[2]。根據(jù)cag致病島的有無,將HP分為I型和II型,I型包含cag致病島[3]。I型比II型更易誘導(dǎo)細胞形態(tài)的改變及更嚴重的炎癥反應(yīng)[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS細胞24 h,48 h,通過ELISA檢測IL-17的濃度,進而討論HP不同分型對IL-17的誘導(dǎo)作用及機制。

1 資料與方法

1.1 AGS細胞的培養(yǎng) 將AGS細胞(購買于中國科學(xué)院上海細胞研究所)接種至培養(yǎng)皿,加入RPMI1640培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。

1.2 HP的培養(yǎng) 在微需氧環(huán)境下,HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株(美國ATCC公司)用哥倫比亞血瓊脂選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 HP不同菌株感染AGS細胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株處于對數(shù)生長期時,分別取少許菌液涂片,用PBS溶液將處于對數(shù)生長期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分別清洗2遍,5000轉(zhuǎn),離心5 min；分別制備HP懸液。

AGS細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的80%時,棄掉原培養(yǎng)基,按細菌：細胞=100：1比例加入HP懸液,放入37℃、5%CO2孵育箱共同培養(yǎng)24 h、48 h。

1.4 ELISA

1.4.1 ELISA檢測IL-17濃度 IL-17酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購買自南京奧尼多福公司,取出上述不同菌株感染的AGS細胞,3000轉(zhuǎn),離心20 min。收集細胞上清,ELISA檢測IL-17濃度。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4.2 待測樣品濃度的計算 以O(shè)D值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),做出標(biāo)準曲線并求出曲線方程,然后根據(jù)待測樣品的OD值在該曲線上求出相應(yīng)的IL-17濃度,再乘以稀釋倍數(shù)5倍,即待測樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,采用t檢驗,計數(shù)資料用率(%)表示,采用χ2檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Bartlett檢驗對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。若方差齊,兩個樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗。若方差不齊,則采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HP不同亞型菌株感染AGS細胞24 h、48 h后誘導(dǎo)IL-17的表達與空白對照組比較 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

表1 HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

注：與空白對照組相比,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h空白對照組 10.01±3.4 10.00±3.2 HP26695感染組 102.17±2.20a 105.87±7.00a HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.2 HP不同亞型菌株誘導(dǎo)IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見表2。

表2 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

表2 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 HP26695 相比 ,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h HP26695感染組 102.17±2.20 105.87±7.00 HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

表3 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 24 h 相比 ,aP＞0.05

不同菌株 HP26695感染組 HPK5感染組24 h 102.17±2.20 124.68±3.32 48 h 105.87±7.00a 126.49±13.45a

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子,其可誘導(dǎo)多種細胞釋放炎癥介質(zhì),IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān),亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關(guān)［5］。研究表明,IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等［6］。同時,亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo)IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集,此外,中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過上調(diào)腫瘤細胞及基質(zhì)細胞IL-6的表達量,IL-6作用于STAT3途徑,從而激活促癌基因的產(chǎn)生,發(fā)揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成［7］。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高,這與蘇濤［8］等研究一致,實驗結(jié)果提示HP可誘導(dǎo)IL-17濃度表達,從而加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果亦顯示,I型HP感染AGS細胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外,大多數(shù)學(xué)者認為IL-17隨腫瘤進展而增加,且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關(guān)［9］,但本實驗結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異,這與上述觀點相悖,有待進一步研究探討,明確是否隨著時間的推移,IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述,在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中,HP不同亞型菌株感染后所誘導(dǎo)IL-17的表達各不相同,尤其I型HP是誘導(dǎo)IL-17濃度表達的重要因素,充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導(dǎo)IL-17濃度表達的作用機制,使IL-17可作為潛在治療靶點,以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

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[6]Kuang DM,Peng C,Zhao Q,et al.Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells.Hepatology,2010,51(1):154-164.

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[8]蘇濤.IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義.第四軍醫(yī)大學(xué),2009.

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