付永瑤， 呂 悅， 王繼宏， 姚 皓， 趙文杰， 宋志琦， 薛志新， 袁 振， 劉春法， 彭 云， 李 超， 趙德明， 楊利峰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，成為生命科學(xué)研究的支撐條件之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尤其是實(shí)驗(yàn)鼠是人類的替身，起著“活的天秤”和“活的化學(xué)試劑”的作用，實(shí)驗(yàn)用鼠的質(zhì)量直接影響科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[1]。因此，實(shí)驗(yàn)用鼠不僅應(yīng)該滿足傳染病學(xué)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，也應(yīng)該符合病理學(xué)的檢測(cè)要求。本文主要對(duì)至2009年至2013年，北京市實(shí)驗(yàn)用鼠的病理學(xué)抽檢診斷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。病理學(xué)診斷是通過直接觀察器官、組織和細(xì)胞的病理特征對(duì)疾病做出診斷，是醫(yī)學(xué)診斷中具有權(quán)威性的一級(jí)診斷，是聯(lián)系基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的重要橋梁。較臨床上的其它診斷，如根據(jù)病史、癥狀和體征等作出的分析性診斷更具直觀性、客觀性和準(zhǔn)確性[2]。

1. 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2009年至2013年，由中國藥品生物制品檢定所在北京市不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)單位分別抽取小鼠、豚鼠和大鼠三種實(shí)驗(yàn)用鼠，均為4～6周齡(表1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織切片的制備和觀察

將動(dòng)物麻醉后處死，采集動(dòng)物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸， 10%福爾馬林溶液固定。按照常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPAS U-S R G數(shù)碼顯微鏡觀察并采圖。

1.2.2 肝臟油紅“O”染色

對(duì)于在HE染色下觀察疑似為脂肪變性的樣品肝臟，抽取部分進(jìn)行脂肪的油紅“O”染色，具體步驟如下：

1)取10%福爾馬林溶液固定的肝臟組織，用水沖洗1 h；

2)組織塊冰凍切片；

3)將油紅“O”稀釋液滴加在載玻片上覆蓋組織，染色8～10 min；

4)60%異丙醇液漂洗30 s，然后蒸餾水再漂洗30 s；

5)蘇木素復(fù)染30 s，之后蒸餾水洗30 s；

6)用甘油明膠封片。

切片用OLYMPAS U-S R G數(shù)碼顯微鏡觀察并采圖。

1.2.3 肝臟PAS染色

同樣抽取HE染色病變陽性的樣品肝臟，做糖原的PAS染色，具體步驟如下：

1)10%福爾馬林溶液固定的組織制作石蠟塊，切片脫蠟下行至蒸餾水；

2)入0.5%高碘酸水液氧化5 min，蒸餾水水洗；

3)Schiff氏試劑染色30～60 min(在37℃的溫箱中進(jìn)行，瓶蓋密封)；

4)亞硫酸液洗2～3次，每次30 s，然后蒸餾水水洗兩次；

5)蘇木素復(fù)染5 min，1%鹽酸酒精分色，充分水洗；

6)脫水透明，封片。

切片用OLYMPAS U-S R G數(shù)碼顯微鏡觀察并采圖。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)鼠的肝臟病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

HE染色切片顯微鏡觀察，正常肝臟肝細(xì)胞排列緊密，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞胞質(zhì)紅染，胞核清晰藍(lán)染(封3圖1)。小鼠、大鼠和豚鼠的肝臟病變主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹變大，胞漿中存在大小不等的空泡，有些空泡融合成大的空泡，胞漿成分明顯減少(封3圖2)。取HE染色的病變肝臟分別進(jìn)行油紅“O”染色和PAS染色。顯微鏡觀察可見，油紅“O”染色陽性的切片中肝細(xì)胞中有大小不等的亮紅色小滴，既是著色的脂肪滴(封3圖3)；PAS染色陽性的切片，部分肝細(xì)胞中有紫紅色著色物質(zhì)，即糖原沉積(封3圖4)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其中部分肝臟兩種染色陽性有交叉，還有一部分病變肝臟兩種染色均為陰性；說明病變肝臟中有一部分同時(shí)發(fā)生脂肪變性和糖原沉積，還有部分可能是因?yàn)槠渌蛞鸬漠惓?，如采樣固定不及時(shí)組織發(fā)生自溶等

表1 2009年10月～2013年10月實(shí)驗(yàn)用鼠采樣情況

2.2 實(shí)驗(yàn)鼠的腎臟病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

HE染色后鏡下觀察，正常腎臟的腎小管輪廓清晰，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，胞核清晰，腎小管管腔內(nèi)無任何物質(zhì)。病變的腎臟腎小囊腔中可見有粉染的蛋白樣物質(zhì)滲出(封底圖5)，偶見腎小球萎縮壞死，腎小管上皮發(fā)生壞死，腎小管管腔中可見粉紅色均質(zhì)性似蛋白樣物質(zhì)，多數(shù)聚集于管腔中間，與上皮有一定間隙，即是形成的蛋白管型(封底圖6)。分析認(rèn)為發(fā)生腎臟病變的實(shí)驗(yàn)鼠可能在飼養(yǎng)時(shí)接觸到具有腎毒性的物質(zhì)或者是處死時(shí)腎臟血量急劇減少造成的。

3 討論

自2009年以來，本實(shí)驗(yàn)室共對(duì)2155例實(shí)驗(yàn)用鼠的健康狀況進(jìn)行了調(diào)查，包括小鼠、大鼠、豚鼠的SPF級(jí)、清潔級(jí)或普通級(jí)。從微生物學(xué)診斷結(jié)果來看，北京市嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本上不攜帶危害人類、其他動(dòng)物和環(huán)境安全的傳染性微生物。從病理學(xué)診斷結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)鼠的心臟、脾臟和大小腸基本正常，部分鼠的肺臟因?yàn)檫\(yùn)輸、處死以及應(yīng)激等環(huán)境因素刺激發(fā)生輕度的炎癥病變。肝臟和腎臟的病變?yōu)閲X類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主要病變，主要有因脂肪或/和糖原沉積引起的肝細(xì)胞腫脹，腎小管的蛋白管型以及腎小球的蛋白樣物質(zhì)滲出。

從肝臟病變的統(tǒng)計(jì)分析來看，小鼠的肝臟病變率從最初的50%逐漸下降為30%左右；2011年和2012年5月大鼠的病變率高達(dá)70%左右，但是自2012年10月起大鼠的病變率發(fā)生了顯著的下降，在最近的一個(gè)檢測(cè)中40例大鼠中僅有2例大鼠的肝臟發(fā)生了病變；豚鼠的病變豚鼠的病變率起伏不定，最近3次檢測(cè)穩(wěn)定在30%左右。對(duì)HE染色病變陽性的肝臟進(jìn)行特殊染色后發(fā)現(xiàn)肝臟的PAS染色陽性率明顯高于油紅“O”染色的病變陽性率，說明糖原沉積是引起實(shí)驗(yàn)鼠肝細(xì)胞腫脹的主要因素。在機(jī)體的不同代謝階段，肝細(xì)胞中有一定量的糖原蓄積也是正常情況。肝臟發(fā)生脂肪變性的原因可能與機(jī)體對(duì)飼料的代謝有關(guān)，鄭長生[5]指出飼料的營養(yǎng)成分過高，尤其是脂類含量偏高將影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，因此，飼料中脂類成分含量過高可能是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟發(fā)生脂肪變性的主要原因。此外，目前我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，不同企業(yè)或同一企業(yè)不同時(shí)期生產(chǎn)的飼料差異很大，表現(xiàn)為飼料組分和含量的穩(wěn)定性較差[6]。所以，盡快建立完善的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料標(biāo)準(zhǔn)有助于提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康水平，進(jìn)而為科學(xué)研究的準(zhǔn)確性和可靠性提供了保障。另外，在所有細(xì)胞腫脹的肝臟中，還有部分肝臟兩種特殊染色均呈陰性，推測(cè)可能是病變較輕微，特殊染色難以鑒別；或者可能是其它原因所致，如顆粒變性等。適用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)鼠的肝細(xì)胞應(yīng)無萎縮、變性以及壞死等病理異常。

從腎臟病變的統(tǒng)計(jì)分析來看，小鼠、大鼠和豚鼠的腎臟病變率均有一定程度的升高，尤其是自2012年10起，實(shí)驗(yàn)鼠的腎臟病變較為嚴(yán)重。其中，小鼠的病變率普遍低于大鼠以及豚鼠的病變率。腎臟病變?cè)诓煌蜋z單位以及不同級(jí)別的實(shí)驗(yàn)鼠中均有發(fā)生。實(shí)驗(yàn)鼠的腎臟病變可能與飼料代謝或飼養(yǎng)過程中接觸到了具有腎毒性的物質(zhì)有關(guān)，應(yīng)引起飼養(yǎng)單位的重視。健康的實(shí)驗(yàn)鼠的腎臟在鏡下觀察時(shí)皮質(zhì)和髓質(zhì)應(yīng)結(jié)構(gòu)完整，無壞死、出血、淤血和異常物質(zhì)滲出等病理變化。

綜上，部分實(shí)驗(yàn)用鼠表現(xiàn)出以肝臟的細(xì)胞腫脹和腎臟的蛋白樣物質(zhì)滲出為代表的病理學(xué)變化，其病變程度不一，在一定程度上會(huì)影響動(dòng)物的生命特征和新陳代謝。希望這些情況可以通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、完善飼料標(biāo)準(zhǔn)來控制，從而增加科學(xué)實(shí)驗(yàn)的成功率。根據(jù)我們調(diào)查結(jié)果，我們建議用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)鼠的心臟、肺臟、脾臟、腎臟、和大小腸等重要的器官在眼觀和顯微鏡檢查時(shí)都不應(yīng)出現(xiàn)病理性異常。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅滿林.顧為望.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[2] 趙德明.獸醫(yī)病理學(xué)[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2013.

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[5] 劉騰，蔣輝.北京市場(chǎng)供應(yīng)部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料檢測(cè)與分析[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué).2011,28(1),73.

[6] 鄭長生.淺談實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的影響[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué).2009,26(5),61-63.

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